农杆菌介导的 植物遗传转化农杆菌的分类按侵染植物的后果分为： 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 形成冠瘿（crown gall） 发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） 形成发根（hairy root）革兰氏阴性菌、杆状；按合成/代谢冠瘿碱（Opine）的种类，根癌农杆菌分为 ：章鱼碱（Octopine）型 胭脂碱（Nopaline）型 农杆碱（Agropine）型冠瘿碱： 农杆菌的碳源及氮源，其他物种不能代谢利用， 使农杆菌拥有了独特的生态位。未侵染时栖息于土壤表层，侵染植物导致冠瘿病（根癌病） ；侵染植物受伤部位（嫁接、修剪或其他外力伤害等）；冠瘿瘤一般位于主根与茎的结合部（树干基部，即冠、Crown），但侧根、茎、枝上也有发病。The Plant Cell, Vol. 18, 33503352冠瘿病的害处：苗木感病后发育受阻；生长缓慢；植株矮小；严重时叶片萎蔫、早衰，甚至死亡； 大树受害后树势衰弱，生长不良，提前落叶，果实变小，树龄缩短。主干受害降低材质及工艺价值。根癌农杆菌含有Ti质粒 Ti：tumor-inducing 发根农杆菌含有Ri质粒 Ri：rhizogenic 天然农杆菌都含有Ti（或者Ri）质粒农杆菌能够导致植物产生冠瘿病的原因： Ti（Ri）质粒天然Ti质粒的结构 200800 Kb含有冠瘿碱合成基因、生长素合成基因、细胞分 裂素合成基因等； 真核启动子；T-DNA区（Transferred DNA）： 农杆菌Ti质粒中向植物中转移并整合进植物基因 组中的部分；T-DNA区大小：1030 Kb 有的Ti质粒只含有一个T-DNA区，有的则含有多个；T-DNA区的左右边界序列高度保守，为25bp的正 向重复序列；http:/www2.haut.edu.cn/d/d/gene/Chapt17/BIO7.asp毒性蛋白区（ Vir区，Virulence）： 包括A、B、C、D、E、F、G等基因区，有的 基因区含有多个基因，形成Operons； Vir区约20Kb； ?冠瘿碱代谢基因农杆菌转化植物的过程植物受伤部位酚类化合物的分泌 附着（chvA、chvB） VirA/G的双组分系统感受受伤信号 （signal to A Pi to G） 其他Vir基因的表达 T-DNA链的切出（VirD1+VirD2；Border to Border） T-complex的形成 运输（从细菌中输出、进入植物细胞、入核） 整合植物受伤后的分泌物中含有酚类物质（包括乙酰 丁香酮，acetosyringone，AS）； 这些酚类物质可以被农杆菌感知，借助于趋化性 迁移至植物受伤部位； 在ChvA、ChvB（染色体毒性基因）等的帮助 下，附着到受伤部位；农杆菌的附着农杆菌在ChvA、ChvB等 蛋白帮助下附着在植物细 胞表面A. tumefaciens形态http:/www2.haut.edu.cn/d/d/gene/Chapt17/BIO7.aspVirA识别植物受伤后 分泌的酚类物质信 号，并自我磷酸化， 进而将磷酸化信号传 给VirG； VirG磷酸化后被活 化，作为转录因子启 动或增加各毒性蛋白 的表达；毒性蛋白基因的激活VirD2在D1的帮助下 识别T-DNA 25bp边 界序列，利用外切 核酸酶的在第3、4 碱基之间形成缺刻; VirD2的Tyr29与缺 刻的5端共价结合； 随着DNA的合成生 成T-DNA单链，与 VirD2和VirE2结合形 成T-complex；http:/bs.shinshu-u.ac.jp/botany/Crown_Gall.htmlT-complex形成http:/www.defra.gov.uk/environment/acre/uti/03.htmT-complex:VirC1突变后导致毒性丧失，其作用可能是与T- DNA右边界附近的overdrive序列结合； Overdrive序列促进T-DNA向植物的转移；T-complex的转运 通过细菌细胞壁上由11个VirB蛋白和VirD4组成的通 道从农杆菌向外输出VirD2： 含有NLS，并可与Importin-以NLS依赖的方式结 合，引导T-complex进入细胞核，并帮助T-DNA插入植 物染色体中； （Importin-is a component of one of the protein nuclear transport pathways found in eukaryotes）T-complex在植物细胞内的运输及整合VirE2： 非特异DNA结合蛋白，包裹T-DNA单链，使DNA 由随机卷曲状态成为与电话听筒线相似的规则螺旋 ；这种形状使T-complex容易穿过核孔； VirE2将T-DNA包裹，可避免T-DNA从细菌向植物 转移过程中被降解；VirE2可在植物细胞膜上形成通道，使T-complex 进入植物细胞； VirE2可与Importin-以不依赖NLS的方式结合， 促进T-complex向核的定向转运； VirE2的NLS与其DNA结合位点重叠，在T- complex向核的转运中可能不起作用； VirE1： VirE2的分子伴侣，可能帮助VirE2与T-DNA单链进 行结合；http:/bs.shinshu-u.ac.jp/botany/Crown_Gall.htmlT-complex进入植物细胞核的模型The Plant Cell (1996) 8: 1699-1710 农杆菌向植物中转移的DNA长度可达到30150Kb； 在T-DNA的左右两边界中，右边界相对更重要，其缺失将导致转基因失败；有时候，T-DNA左右边界之外的载体序列也有可能被转到植物基因组中。 原因是： 1）T-DNA单链在形成过程中越过了左边界； 2）T-DNA的转移从左边界起始；补充几点：农杆菌特异性的将T-DNA区转入植物的基因组中，其转移由T-DNA边界决定，与T-DNA区内的DNA序列无关。 利用这种特性，我们就可以将外源基因插入到T-DNA区中，达到转基因的目的。农杆菌载体系统的演化解甲（disarmed） 共整合载体（co-integrated plasmid） 双元载体系统（binary vector system）农杆菌介导的植物转化 对自然从发现到认识到利用解甲： 去除对转基因有不良影响的生长素、细胞分裂素 合成等基因； Ti质粒只有被解甲之后才能运用到人工转基因实 验中。 农杆菌被解除武装，成了我们的俘虏，从而为人 类服务。共整合载体Vir区及T-DNA区的反式作用 ?双元载体的发明 存在于工程菌株中的大质粒（Vir区）； 方便体外操作的小质粒（含T-DNA区，大约 十几个Kb）；Binary vector systemABC农杆菌载体系统的 演化过程： 从野生型质粒 到共整合载体 到双元载体系统植物农杆菌转化的发展农杆菌的天然寄主：双子叶植物； 植物的农杆菌转化由双子叶植物开始 已被转化的双子叶植物：烟草、马铃薯、番茄、茄子、 大豆、甜菜、拟南芥菜等； 单子叶植物转化：20世纪90年代之后； 已被农杆菌成功转化的单子叶植物：石蒜科、百合科、 鸢尾科、薯蓣科和禾本科； 禾本科植物的转化 水稻：Hiei等（1994） 水稻能被成功转化是其成为禾本科模式植物的基础。 玉米：Ishida等，1996 大麦：Tingay等，1997 小麦：Cheng等，1997；Xia等，1999禾本科植物转化的几个经典实验Hiei et al (1994) The Plant Journal 6(2): 271-282The Plant Journal (1994) 6(2): 271-282Tingay et al (1997) The Plant Journal 11 (6): 1369-1376Cheng et al (1997) Plant Physiol. 115: 971-980从以上实验可总结转基因植株的鉴定方法有：抗生素抗性标记；GUS染色（组织化学染色）；Southern杂交；PCR检测； RT-PCR检测； Northern杂交； 蛋白电泳； 等等；PCR（A）、RT-PCR（B）和 Southern（C）鉴定结果ABC影响植物农杆菌转化效率的因素植物品种（基因型效应）； 农杆菌菌株及载体； 起始材料； 侵染所用菌浓度（OD值）； 共培养条件(温度、时间、光照、培养基成分)； 共培养之后的筛选方式； 等等；