2008 年螺旋讲堂第十一课-“基因启动子分析基本流程” “螺旋课堂螺旋课堂”2008年第十一课年第十一课-“基因启动子分析基本流程基因启动子分析基本流程” 螺旋 亲爱的螺友们好，大家好！欢迎光临螺旋讲堂，很高兴有机会和大家相聚螺旋网，让我们一同在讨论中学习，在交流中成长！ 分子生物学发展迅猛，新方法新技术新发现层出不穷，但是我想,我们的基础研究从某种意义上来说，可以简单的分为两大部分，一个是基因的表达，另一个是基因的功能。当然，这个基因的概念现在已经不仅仅是指编码蛋白的核苷算序列了。 我们这期主要探讨基因的表达。 而转录调控在基因表达中占有很重要的地位。 基因的转录调控机制非常复杂，这些理论有机会我们再详细探讨，这里就不多介绍了，我们主要谈一下对于一个新的基因，如何开始他的转录调控研究，第一步到底该怎么做呢？ 这里提供一些简单的入门级别的方法，希望对大家有用。相信还有更多更好更实用的方法，也希望螺友们能够拿出来和大家分享，共同进步！ 本次讲座共分为五个部分主要是讲第一部分,因为这个一般的文献和书籍都很少有详细说明. 一：克隆目的基因基本启动子序列 我们都知道， 基因的基本启动子一般是在基因转录起始位点上游， 当一个基因在没有确定其转录起始位点的时候，我们假定 NCBI 上提交的序列就是他的完整转录本，那么他的第一个碱基就是他的转录起始位点。而基因的基本启动子一般就是在转录起始位点的上游2000bp左右和下游200bp 左右， 当然,这个是一般情况,具体问题还要具体分析.尤其现在发现一般的基因都是有几个转录起始位点的. 我们通过该基因mRNA序列和基因组序列BLAST， 就能够在染色体上找到这段基因组序列。我这里用 human 的 AGGF1基因做个例子给大家具体演示一下. 2008 年螺旋讲堂第十一课-“基因启动子分析基本流程” 1 首先需要在 NCBI 里面查找到 AGGF1基因的 mRNA 序列,这个我想大家都应该很清楚,如下图. 2008 年螺旋讲堂第十一课-“基因启动子分析基本流程” 2 然后就是用这段 mRNA 序列和人类的基因组序列 BLAST 3 BLAST 得到了很多结果，我们往往选择最上面那个最匹配的结果。 2008 年螺旋讲堂第十一课-“基因启动子分析基本流程” 4 点击之后就可以看到下图， 这个基因的14个外显子和13个内含子在5号染色体上的位置一目了然，第一个外显子在上面，说明这个基因在染色体上是正向的，基本启动子就应该在第一外显子上面，我用红色的方框标明了。 2008 年螺旋讲堂第十一课-“基因启动子分析基本流程” 5 大家有没有注意到左上方有个数据框，可以适当放大你的核心区域，我把数值改为 76,360K 到 76,362.200 ,刚好2200BP,包括了第一个外显子的前200BP 左右. 然后点击红色框标明的 Download/view sequence. 6 然后就到了这个界面, Sequence Format 选择 GenBank, 然后点击 Display. 就得到我们所需要的序列了. 2008 年螺旋讲堂第十一课-“基因启动子分析基本流程” 7 这里我们可以看到1989到2201是 AGGF1的 mRNA 序列,说明我们的确找到了该基因5非翻译区的上游启动子序列.建议将这2200bp 都克隆下来. 2008 年螺旋讲堂第十一课-“基因启动子分析基本流程” 以上的步骤就是基因基本启动子的查找,其实还有很多调控序列是在基因内含子区域或者是基因的3非翻译区等,序列查找的步骤和上面是一样的. 8 还有一个方法更加简单,那就是用 AGGF1的 前60bp 序列和 nucleotide 数据库 BLAST,可以得到该序列在染色体上的位置,需要注意的是,如果是反向的序列的话,我们就要选择反向互补的序列. 2008 年螺旋讲堂第十一课-“基因启动子分析基本流程” 相信大家在使用的过程中会有更多的发现. 二：软件预测顺式作用元件，做点突变分析 得到这些序列后,克隆进没有启动子载体 pGL3或者 pTAL-luc 中去，转染细胞, 测定荧光活性，如果有很强的活性,那么说明你已经成功克隆到了该基因的基本启动子. 然后可以通过5非翻译区一系列的缺失突变，不断把范围缩小,找到哪一段序列对于该基因的启动子活性是必须的或者是最重要的。 当找到这个比较核心的启动子序列后， 可以通过一些在线的软件去预测其顺式作用元件的位点,每个在线软件都有自己独特的算法分析,得到的结果并不都是可靠的,每个软件都有自己的优势，需要多综合一些软件预测的结果,并通过分析预测出来的转录因子是不是和该基因有功能上的联系等做进一步的选择，继续做下面的验证实验。 下面这两个有商业化的软件，有条件的朋友可以用。 http:/www.genomatix.de/http:/www.gene-regulation.com/pub/databases.html#transfac 下面这两个是免费的，用起来很方便。 http:/www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.htmlhttp:/www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess2008 年螺旋讲堂第十一课-“基因启动子分析基本流程” 我用 TESS 举个列，直接在首页下面的方框里输入你要分析的序列就可以了。 同样在首页，通过下面的方框，你可以查找一些转录因子的相关信息. 了解转录因子结合 DNA 的保守序列后，就可以用重叠延伸 PCR 的方法针对几个最重要的碱基做点突变。 有时候,你可以突变2-3个碱基,这样有效果会更好. 同时突变避免形成新的转录因子的结合位点,提交引物之前把突变后的序列也要通过上面的软件预测一下. 2008 年螺旋讲堂第十一课-“基因启动子分析基本流程” 以下的相关实验都有试剂盒,并且说明书都写的非常详细,实验步骤就不多说了,主要说明下面该做哪几个实验,以及该实验的意义. 三：EMSA 实验在体外验证顺式作用元件同反式作用因子的结合 反式作用因子一般指的就是转录因子,顺式作用元件一般是指转录因子和启动子结合的那部分序列,一般是10-20bp 左右. 点突变证实该顺式作用元件对于启动子活性是有影响的,接下来就要用 EMSA 实验验证反式作用因子和该顺式作用元件在体外是有直接结合的.,反式作用因子可以用细胞核抽提物做，也可以用体外表达纯化的蛋白，也可以用该反式作用因子的抗体做 Super shift 实验，进一步证实该证顺式作用元件同反式作用因子的特异性结合。 四：CHIP 实验在体内验证顺式作用元件同反式作用因子的结合 当 EMSA 实验得到阳性结果后,还是不能最后肯定该反式作用因子和该顺式作用元件有结合.毕竟体外的结合并不能代表生理条件下的结合.接下来就要用染色质免疫沉淀(ChIP) 技术来证实在体内的生理条件下该顺式作用元件和该反式作用因子是有结合的. 五：过表达和干扰反式作用因子情况下用 RT-PCR 验证目的基因的表达情况 那么,反式作用因子和顺式作用元件有结合,就一定会影响该基因的表达吗?很多时候很多转录因子一起形成复合体才有调控作用,于是我们要在过表达和干扰该反式作用因子的条件下,做 RT-PCR 看目的基因的表达是否有变化.这个才能最后说明反式作用因子和顺式作用元件结合后真的能够调控目的基因的表达, 对于以上很多的实验,选取细胞系是非常重要的,在不同的细胞系,目的基因的表达是有区别的,因此,只有在某种细胞系才会得到理想的结果. 祝福大家好运!