分类号：R 7 3 7 9密- 级：学位类别：科学学位由专业学位口学校代码：100 62学号：2 0 1 0 6 0 2 5 1 3学科门类：医学 夭肄眚科矢辱硕士学位论文M A S T E R SD I S S E R T A T I O N论文题目：Z E B l 对上皮间质转化及E S R P l 表达的调控机制研究TIT L ES t u d yo nt h em e c h a n i s mo f Z E B li nt h er e g u l a t i o no fE M Ta n dE S R P le x p r e s s i o n一级学科：临床医学二级学科：肿瘤学论文作者：李丹华指导教师：曹旭晨教授导师组成员：张斌副主任医师天津医科大学研究生院二。一三年五月学位论文原创性声明I HI M M I M I H I Y 2 3 9 6 6 6 7本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：蛰玺日期：砂侈年f 月彪日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在年解密后适用本授权书。本论文属于 不保密函。( 请在相对应的方框内打“”)学位论文作者签名：垄盘生日期：l 年r 月，6 日导师签名：日期：少，3 年月名日天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：研究Z E B l 对上皮间质转化及E S R P l 表达的调控机制。方法：1 用T G F p 诱导常规培养的肺癌A 5 4 9 细胞，通过W e s t e r nB l o t t i n g 试验，检测相关标志物如Z E B l 、E S R P l 、E c a d h e r i n 、N c a d h e r i n 和f i b r o n e c t i n 的变化。用慢病毒L V - Z E B l s i R N A 和L V - N C s i R N A 感染A 5 4 9 细胞，分四组：L V - Z E B l s i R N A 组、L V - N C s i R N A 组和用T G F p 刺激4 8 h 后再感染L V - Z E B l s i R N A 组、L V - N C s i R N A 组，W e s t e mB l o t t i n g 试验检测E S R P l 、E - c a d h e r i n 、N c a d h e r i n 和f i b r o n e c t i n 的变化；划痕试验和侵袭试验检测Z E B1沉默对细胞运动能力的影响。2 构建Z E B1 真核表达载体，转染A 5 4 9 细胞，W e s t e mB l o t t i n g 试验检测空白对照组( 未转染) 、实验组( 转染p c D N A 3 1 m y c H i s Z E B l ) 和阴性对照组( 转染空载体p c D N A 3 1 m y c H i s ) 中E S R P l 、E c a d h e r i n 、N c a d h e r i n 和f i b r o n e e t i n的变化；划痕试验和侵袭试验检测Z E B l 高表达对细胞运动能力的影响。为进一步研究Z E B l 对E S R P l 的调节，构建E S R P l 荧光素酶报告基因载体p G L 4 1 7 - E S R P l ，将重组质粒p G I A 1 7 - E S R P l 和p c D N A 3 1 m y c H i s - Z E B l 及内参质粒共转染A 5 4 9 细胞，4 8 h 后测定实验组( 重组质粒p G L 4 1 7 一E S R P l 和p c D N A 3 1 m y c H i s Z E B l 及内参质粒共转染) 、阴性对照组( 重组质粒p G L 4 1 7 一E S R P l 和空质粒p c D N A 3 1 m y c H i s 及内参质粒共转染) 和阳性对照组( 共转染6 h 换液后加入T G F p 刺激) 的荧光素酶活性。结果：1 ( 1 ) 经T G F B ( 5 n g m 1 ) 刺激后，A 5 4 9 细胞发生E M T ，E - e a d h e r i n 和E S R P l表达减少：N c a d h e r i n 、f i b r o n e e t i n 和Z E B1 表达增加。感染Z E B1 s i R N A 与感染N C s i R N A 的细胞相比，Z E B l 蛋白的表达受到明显抑制；而且感染Z E B l s i R N A 的细胞，T G F D 刺激导致的上皮标志物E c a d h e r i n 和E S R P l 的表达减少被逆转；而间质标志物N c a d h e r i n 和f i b r o n e c t i n 的表达增加未受明显影响。( 2 ) 划痕试验：与阴性对照组相比，T G F p 组划痕大部分愈合( J P O 0 5 ) ；p e D N A 3 1 m y c - H i s Z E B l 组与这两组比较，迁移速度较快( P 0 0 5 ) ；p c D N A 3 1 m y c H i s Z E B l 组与这两组比较，穿膜细胞明显增多( 尸 O 0 5 ) ；T G F p 刺激后，N C 组和Z E B l 一s i R N A 组穿膜细胞数分别为1 7 8 7 士8 1 、1 4 5 7 士5 9 ，Z E B l s i R N A 组穿膜细胞明显减少( P 5 0 p 1 ) 的E n d o f f e eE l u f i o nB u f f e r ，洗脱质粒D N A 。将离心管中的洗脱液再次加到D N A 柱的正中间，室温放置1 分钟，1 3 ，0 0 0r p m 离心1 分钟，收集洗脱液到同一个离心管中。2 1 2 2 细胞转染1 接种细胞：取稳定传代后处于对数生长期的细胞用于此实验。转染前一天将细胞接种至六孔板内，细胞接种数量视其生长速度而定，一般按3 x 1 0 5 个m l 密度接种，使其在转染日饱和度约为9 0 9 5 。铺板时使用不含抗生素的培养液。2 转染液的配制：将4 鹏的质粒D N A 加至2 5 0 肛1 的R P M I1 6 4 0 培基中，混匀。将1 0 山的L i p o f e e t a m i n e2 0 0 0 加至另外2 5 0 斗1 的R P 1 6 4 0 培养基中，轻轻混匀。天津医科大学硕士学位论文二、Z E B l 真核表达载体的构建及对E M T 过程和 E S R P l 表达的影响室温静置5 分钟。将上述两种悬液混合，总体积5 0 0 9 l ，轻轻混匀，室温静置2 0分钟。3 转染细胞分三组：( 1 ) 实验组：A 5 4 9 细胞转染质粒p c D N A 3 1 m y c H i s Z E B l ，( 2 ) 阴性对照组：A 5 4 9 细胞转染质粒p c D N A 3 1 m y c H i s ，( 3 ) 空白对照组：A 5 4 9细胞按常规方式培养。4 使用新鲜的R P M I1 6 4 0 培养基( 无抗生素及血清) 在转染前漂洗细胞，并加入新鲜培养基1 5 m l ，将步骤2 中所得5 0 0 9 l 混合液加至六孔板的孔内，前后左右晃动孔板混匀，置于3 7 ，5 C 0 2 孵箱中培养6 h 。5 转染6 h 后，细胞换液，每孔2 m l 培养基，于孵箱中继续培养。6 转染4 8 h 后，收集细胞检测表达。2 1 2 3W e s t e r nB l o t t i n g 检测Z E B l 基因转染对E M T 标志物的影响提取细胞蛋白分三组：空白对照组、阴性对照组及p c D N A 3 1 m y c H i s Z E B l 组，其余步骤同第一部分。2 1 2 4 划痕试验将A 5 4 9 细胞接种于6 孔板内培养，分实验组、阴性对照组、空白对照组进行转染，4 8 h 后开始划痕试验，步骤同第一部分。2 1 2 5 侵袭试验试验分三组：空白对照组、阴性对照组及p c D N A 3 1 m y c H i s Z E B I 组，其余步骤同第一部分。2 1 2 6 荧光素酶试验2 1 2 6 1P C R 反应：依据N C B I 中E S R P l 基因序列，通过O l i 9 0 6 软件设计上下游引物，上、下游分别引入限制性内切酶K p nI 和X h oI ，上游引物：5 G G l A C C A G C C G Q 蚣。C C C A r 门陷T G A C T 3 ，下游引物：5 C T C G A G A G G C C G T C A r G A C G A I A G G T G 3 ，预计扩增长度为2 0 3 7 b p 。模板为本实验室冻存的基因组D N A ，按表6 配置2 5 m反应体系：天津医科大学硕士学位论文二、Z E B1 真核表达载体的构建及对E M T 过程和 E S R P l 表达的影响表6 P C R 反应体系反应体系组成加样体积( m )P r e m i xP r i m e s S 。I A RH S模板D N A上游引物下游引物 D M S O无R N A 酶水总体积反应条件：9 8 5 m i n ( 预变性) ，9 8 1 0 s ( 变性) ，5 5 2 0 s ( 退火) ，7 2 2 5 m i n( 延伸) ，共3 5 个循环，最后7 2 保温1 0 m i n ，4 。C 保持。P C R 产物进行1 琼脂糖凝胶电泳，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。2 1 2 6 2E S R P l 荧光素酶报告载体的构建将纯化回收的P C R 产物与p G L 4 1 7 载体分别用K p nI 和X h oI 双酶切、回收，然后将回收产物在T 4D N A 连接酶作用下4 。C 连接过夜，将连接产物按照p E A S Y o T l 克隆试剂盒转化，培养后取阳性克隆菌落进行酶切鉴定及基因测序。选择正确的产物命名为p G L 4 1 7 E S R P l ，进行下一步实验。2 1 2 6 3 重组启动子质粒转染1 转染前一天将细胞接种至六孔板内，使其在转染日饱和度约为9 0 9 5 。铺板时使用不含抗生素的培养液。2 转染液的配制：将内参照载体p h R L 、2 腭的重组质粒p G I A 1 7 一E S R P l 和2 腭的目的质粒加至2 5 0 山的R P M I1 6 4 0 培养基中，混匀。将l O 山的L i p o f e c 伽血n e2 0 0 0 加至另外2 5 0 1 x l 的R P M I1 6 4 0 培养基中，混匀。室温静置5 分钟。将上述两种悬液混合，总体积5 0 0 f l ，轻轻混匀，室温静置2 0 分钟。3 转染细胞分三组：( 1 ) 实验组：重组质粒p G L 4 1 7 E S R P l 和p e D N A 3 1 m y c H