分类号密级华中农业大学硕士学位论文奶牛B o L A I 重链在子宫上皮细胞的表达调控及其在 主要组织细胞分布的研究T h eE x p r e s s i o nR e g u l a t i o ni nU t e r i a lE p i t h e l i a lC e l l s 加v i t r o a n dT h eD i s t r i b u t i o ni nM a i nT i s s u e so fB o L A - IH e a v yC h a i ni nD a i r yC o w s研究生：肖雅学号：2 0 1 0 3 0 2 1 1 0 2 2 1指导教师：邓干臻教授指导小组：邓干臻教授专业：临床兽医邱昌伟副教授研究方向：兽医临床诊断学获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2 0 1 3 年6 月华中农业大学动物科学与动物医学学院二。一三年六月洲【Y 2 3 9 3 9 4 6本课题由国家自然科学基金资助( 资助编号：310 7 218 8 ，312 7 2 6 31 )华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学能论文 否如需保密，解密时闻年月目是秀傈密独创性声明本人声明所星交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，狳了文中特别加v , 标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或涯书丙使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生签名：盔训王帆山f 三年6 月舭学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，帮学生必须按鞭学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权镰存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缝窜或拓措等复制手没保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方武在不同媒体上发表、传播学位论文约全部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，麓对本人保留在其他媒体发表论文的权力。注：保密学位论文( 帮涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文) 在解密后适翔予本授权书学位论文作者张蔑准导师鲐卵海一签名日期：枷B 年厶月拶疆签名目期：R 年( ) 月l ，奶牛B o L A - I 重链在子宫上皮细胞的表达调控及其在主要组织细胞分布的研究目录摘要iA B S T R A C T i i i缩写词表vl 前言11 1M H C 的发现及分类11 1 1M H C 1 分子的结构21 1 2M H C I 类分子的分布与功能51 3B o L A - I 的研究进展81 1 3B o L A 的遗传规律一81 1 4B o L A 与奶牛的妊娠免疫81 4I F N 1 7 的研究进展91 1 5I F N t 的特点91 1 6I F N t 在妊娠免疫中的作用1 01 5 研究的目的及意义1 22 材料及方法1 32 1 试验材料一1 32 1 1 试验动物1 32 1 2 质粒和菌种132 1 3 主要仪器一1 32 1 4 主要试剂及试剂盒一1 42 1 5 主要溶液及培养基的配制一152 2 试验方法1 92 2 1 样品的采集及预处理一1 92 2 2 引物设计2 02 2 3 总R N A 的提取与反转录2 12 2 4B o L d I 重链的克隆、载体构建及测序一2 22 2 5 表达载体的构建2 7华中农业大学2 0 1 3 硕士学位( 毕业) 论文2 2 6 重组质粒的诱导表达及鉴定2 82 。2 7 包涵体的提取与纯化2 92 2 8 蛋白浓度的确定3 02 2 9B o L A I 重链多克隆抗体的制备3 02 2 1 0 免疫血清效价测定3 22 2 1 l 免疫组化检测组织中B o L A I 重链的分布3 32 2 1 2 奶牛子宫上皮细胞的培养3 42 2 1 3I F N T 对B o L A I 重链表达调节的试验设计，3 42 2 1 4R T - q P C R 检测I F N T 干预子宫上皮细胞表达B o L A I 重链3 52 2 ，1 5W e s t e r nb l o t 验证I F N 下干预子宫上皮细胞表达B o L A I 重链的结果3 63 实验结果与分析3 73 1 奶牛B o L A - I 重链序列分析3 73 2 肝脏中总R N A 的提取3 93 3 牛B o L A I 重链基因的克隆与鉴定3 93 4 重组质粒基因原核表达载体构建与鉴定4 03 4 1 酶切鉴定4 03 4 2 测序鉴定4 13 5 蛋白的诱导表达及鉴定4 23 5 1 表达蛋白的S D S P A G E 检测，4 23 5 2 蛋白的可溶性鉴定4 33 5 3 蛋白的浓度测定4 33 6 多克隆抗体的鉴定4 33 6 1E L I S A 法测定抗体效价4 33 6 2W e s t e r nB l o t 检测抗体特异性4 43 7 多克隆抗体的应用4 53 7 1 免疫组化分析B o L A I 重链在主要组织细胞中的分布4 53 8 目的基因片段的扩增及鉴定4 83 9R T - q P C R 结果5 03 9 1 扩增产物的质量5 01 1奶牛B o L A - I 重链在子宫上皮细胞的表达调控及其在主要组织细胞分布的研究3 9 2 扩增的特异性513 9 3 数据结果的分析处理5 23 9 4W e s t e r nB l o t 检测蛋白水平B o L A I 重链的表达5 34 讨论5 54 1B o L A - I 重链的克隆表达及多克隆抗体的制备5 54 2 免疫组化法检测牛B o L A I 重链分子在各组织的分布情况5 64 3I F N T 对子宫上皮细胞B o L A 重链表达的调控5 75 结论6 l参考文献6 2致谢7 1奶牛B o L A I 重链在子宫上皮细胞的表达调控及其在主要组织细胞分布的研究摘要哺乳动物妊娠过程中，胚胎作为“同种半异体”而不被母体免疫排斥，主要是通过调控母胎界面的主要组织相容性复合体( M H C ) 的时相性表达来实现的。M H C 1分子在胚胎着床的“窗口期”的子宫内膜上的时相性表达对免疫耐受的调控及妊娠的建立具有重要作用。M H C I 重链( h e a v yc h a i n ) 是经典的M H C I 类分子，为I 类分子共用结构，其表达情况能够较为完整地反映I 类分子的整体表达情况。奶牛的M H C I 又称牛白细胞抗原I ( B o L A I ) 。I F N t 只在反刍动物滋养层细胞的围植入期表达，并且作用于母体的子宫内膜，被认为是反刍动物胚胎向母体发出的最早的妊娠识别信号。据此推测I F N T 对子宫上皮细胞的B o L A I 类分子的表达具有调节作用。由于M H C 。I 与妊娠有关，所以，本试验对子宫、卵巢、肝脏和脾脏的表达情况进行了检测，以期比较其在生殖器官的表达特点。本研究的完成为探索I F N 一卜B o L A I重链一子宫上皮细胞之间的免疫调节通路提供依据，并能够为进一步阐明奶牛着床期子宫内环境奠定科学依据和理论基础。( 1 ) B o L A - I 重链的克隆、表达并制备其多克隆抗体。从荷斯坦牛肝脏组织提取总R N A 并利用R T P C R 反转录成c D N A 。根据G e n B a n k 上已发表的B o L A 。I 重链序列设计引物，然后用高保真酶扩增得到B o L A I 重链C D S 序列，构建p G E X 4 T 表达质粒，转化R o s e t t a ( D E 3 ) 表达菌株，诱导原核表达。包涵体蛋白纯化后免疫新西兰兔，制备多克隆抗体。W e s t e r n B l o t 鉴定B o L A I 重链抗体的特异