淋巴细胞分离技术实验目的 掌握密度梯度离心分离细胞的方法及原理 。 了解常用的细胞分离方法。实验原理 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F H)分层液(商品名为淋巴细胞分离液) ,比重 1.0770.001 。 红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底 ；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于 分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面 上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。 吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中 分离到单个核细胞。 实验材料 健康人新鲜全血 淋巴细胞分离液 生理盐水 RPMI1640粉末 实验步骤 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 取肝素抗凝静脉血与等量生理盐水充分混 匀，用刻度吸管沿管壁缓慢叠加于分层液 面上，注意保持清楚的界面。水平离心 2000rpm20分钟。 用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置 入另一离心管中，加入倍以上体积的生 理盐水，1500rpm10分钟，洗涤细胞两 次。 末次离心后，弃上清，加入含有10小牛 血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细 胞悬液与一滴0.2台盼兰染液混合，于血 球计数板上，计数四个大方格内的细胞总 数。单个核细胞浓度(细胞数1毫升细胞悬液)4个大方格内细胞总数 102(稀释倍数)4 6. 分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳 培养箱培养。注意事项 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增 加死细胞数。 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机 转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持 清晰的界面。