中国医科大学硕士学位论文ASCI后两种cNOS亚型的变化及L-Arg对其影响的实验研究姓名：孙韶华申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：路磊20030301审文箍要前言f ( 蠹夔损伤后会出现器发牲损伤及由其弓l 起的一系列级联放大的迟发性神经坏死而造成的继发性损伤，同时也会出现一系列保护修复姓的反应，羰渡少脊髓损伤并促进脊髓损伤的修复。嚣翦研究发现S C I 后，N O N O S 既有损伤作用又有保护作用。N O N O S对S C I 夔损伤主要是扶享孛经生化方蘑趣夔S C I ，西猿少脊髓损伤及促进麒修复主要是通过血管机制进行的。同时研究发现，e N O S 的 嚣个逆型中，n N O S 在辨缀生化方面热重S C I 孛趁重要作照，嚣e N O S 在血臀机制方面减轻脊髓损伤及促进修复中起主要作用。 瑟A S C I 磊嚣静e N O S 如俺变化凌待进一步研究。手零实验鹭在骚 究A S C I 后两种e N O S 亚烈如何变化，及腹腔注射L A r g 对其的 影镌，为扶N O N O S 入手，揉铡S C I 磊的损伤撬铡，发挥S C I 后约保护机制，从而找到治疗S C I 的最佳方法奠定基础。f 实验材料 一、实验动物及分组德康纯系W i s t a r 太鼠S O 只，雌雄不分，体羹2 5 0 3 0 0 9 ，随机分组。轰组：燕常对照缝5 哭。4B 组：假手术缀1 5 只。行单纯椎板切除术，分术后3 0 分、1 小嚣雩、2 小时三个时煮，每个时点各隽5 灵。C 组：单纯S C I 组1 5 只。进行S C I ，分术后3 0 分、1 小时、2 小时三个时点，每令时点各炎5 哭。D 组：S C I 及腹腔注射L A r g 组1 5 只：S C I 后立即予以腹腔1 、 、r注射L A r g ，2 9 K g ，分术后3 0 分、1 小时、2 小时三个时点，每个时点各为5 只。二、主要试剂 1 兔抗鼠n N O S 抗体及e N O S 抗体 2 即用型S A B C 试剂盒及D A B 显色试剂盒3 L A r g 注射液5 9 2 0 l I l l三、主要仪器1 改良A l l e n S 打击器( 自制)2 石蜡切片机3 O l y m p u sB X 6 0 光学显微镜，X I O 手术用显微镜4 0 1 y m p u s D P l 0 显微数码照相机5 O l y m p u sc W 9 5 软件，M e m M o r p h 全自动真彩色图像分析仪实验方法一、动物模型制备应用A l l e n S 重物打击法造成实验组大鼠胸髓( T 1 0 ) 节段中度损伤。致伤能量为8 0 9 c m ；假手术组仅行T 1 0 全椎板切除术，不损伤脊髓。二、标本采集，石蜡切片的制作、H E 及免疫组织化学染色对照组，行椎板切除术后于1 0 手术用显微镜下直接将脊髓标本取出；假手术组，单纯切开椎板后，分别于3 0 分、1 小时、2 小时三个时点将脊髓标本取出；S C I 组，于脊髓损伤后分别于3 0 分、 1 小时、2 小时三个时点取材；S C I + L A 玛组：脊髓损伤后，立即腹腔注射L A r g ( 5 9 2 0 m 1 ) ，分别于3 0 分、1 小时、2 小时三个时 点取材。上述标本取材后制成石蜡切片，分别行l i E 染色及免疫 组织化学染色( n N O S 及e N O S ) ，方法采用S A B C 法，应用D A B 染2 色。三、标本的观测及实验结果的分析 t 。竞镜下通过H E 染色观察各组脊髓攒伤情况。 2 光镜下观察备组n N O S 及e N O S 染色，比较静组阳性物质静分帮。3 图像分析：每组取5 张免疫组化切片，每张切片从前角至 震煮备敬5 个赛倍视野进行隧像采集及窭像分撬。测定n N O S 及 e N O S 阳性反臆物的平均灰度值( A v e r a g eg r a yv a l u e ，A G ) 筒光密度懂( O p t i c a ld e n s i t y ，O D ) 。对实验数据进褥统计学分据，耩方差 分析及t 检验，P 0 0 5 。故说明仅行椎板切除术对n N O S 活性无明显影响。表2 结果显示S C I 组三个时点的A G 值均低于正常对照组，O D 值高于正常对照组，且有显著性差异，说明S C I 后n N O S 活性明显升高，且l h 时间点活性最 高( 如图1 示) 。表3 结果示腹腔注射L 一崦组的三个时点，A G值均低于S C I 组，O D 值均高于S C I 组，有显著性差异，说明注射L A r g 后，n N O S 活性高于S c I 组( 如图2 示) 。 2 e N O S 活性的变化：表4 显示，假手术组3 个时点的A G 值与O D 值与正常组无明显变化，P 0 0 5 ，故说明椎板切除术对e N O S 活性无明显影响。表5 示S C I 组三个时点的A G 值均低于1 9 表1 假手术缓与对照组n N O S 滔牲懿院较P O 0 5表2S C I 后n N O S 的变化+ P 0 0 5表5S C I 后e N O S 的变化P ：S C I 机理及治疗是当前脊柱外科领域一大难题，人们 从各方面进行大量的研究，N O N O S 的研究为S C I 提供了一个新 的视角。通过对N O N O S 的研究可以使我们对S C I 有更深刻的认识，为我们从N O N O S 人手或以N O N O S 协助其他治疗手段治疗S C I 提供了广泛的应用前景。目前还可以从如下方面对N O N O S进行更深入研究：1 N O N O S 对S C I 最终是有利还是有害应作进一步研究，或如何控制其有害作用发挥其有利作用寻找最佳解决办法。2 N O N O S 是否是神经元死亡的直接原因。如果是，可以以其为突破口寻找对S C I 的最佳治疗方法。如果不是，可以通过 对其的研究寻找更直接的原因。3 目前N O S 的研究已进入了基因水平，通过基因水平的研究可以为我们从基因水平调控N O N O S 提供了广阔前景。S C I 具有复杂的病理生理过程，仅以N O N O S 来诠释其全部机理是不现实的，但通过N O N O S 的研究结合其他对S C I 的研究，S C I 的治疗是会有突破性进展的。5 1 参考文献1 S c h m i d tH W ，W a l t e rU Oa tw o r k ，C e l l ，1 9 9 4 ，7 8 ：9 1 9 9 2 5 2 S n v d e rS H N i t r i co x i d e ：f i r s ti nan e wc l a s so fn e u r o t r a n s m i t t e r s S c i e n c e ，1 9 9 2 ，2 5 7 ；4 9 4 4 9 6 3 F o r s t e r m a n nU ，G o r s k yL D ，P o U o c kJ S ，e ta 1 R e g i o n a ld i s -t r i u f i o no fE D R F N O s y m t h e s i z i n ge n z y m e ( S ) i nr a tb r a i n B i o c h e mB i o p h y sR e sC m m u n ，1 9 9 0 ，1 6 8 ；7 2 7 - 7 3 2 4 C a w s o nV L ，B r a h m b h a t tH P M o n gJ A ，e ta 1 E x p r e s s i o no fi n d u c i b l en i t r i co x i d es y n t h a s ee a r s ed e l a y e dn e u r o t o x i c i t yi np r i m a r ym i x e dn e u r o n a l g l i a lc o r t i c a lc u l t u r e s N e u r o p h a r m a c o l o g y ，1 9 9 4 ，3 3 ；1 4 2 5 1 4 3 0 5 Y u nH Y ，D a w a o nV L ，D a w s o nT M N e u r o b i o l o g yo fn i t r i co x i d e J C r i tR e vN e u r o b i o l ，1 9 9 6 ，1 0 ；2 9 1 - 3 1 6 6 D u nN J ，D u nS L F o r s t e r m a n nU ，e ta 1 N i t r i co x i d es y m t h a s ei m m u n e o r e a c t i v i t yi nr a ts p i n a lc o r d N e u r o s c iL e t t ，1 9 9 2 ，1 4 7 ；2 1 7 2 2 0 7 W i n k l e rT ，S h a r m aH S ，S t a l b v e r gE ，e ta l ，S p i n a lc o r de v o k e dp o t e n t i a l sa n de d e m ai nt h ep a t h o p h y s i o l o g yo fr a ts p i n a lc o r di n -j u r y I n v o l v e m e n to fn i t r i co x i d e J A m i n oA c i d s ，1 9 9 8 ，1 4 ；1 3 1 1 3 9 8 Y i c kL W ，W uW ，S oK F ，e ta 1 T i m eC O U l 瞎eo fN O Se x p r e s s i o na n dn e u r o n a ld e a t hi nC l a r k en u c l e u sf o n o w i n st r a u m a t i ci n j r yi na d u l tr a ts p i n a lc o r d J N e r r o s c iL e t t ，1 9 9 8 2 4 1 ；1 5 5 1 5 8 9 赵立，李涛，贾连顺脊髓损伤后一氧化氮合酶活性变化的动 态观察及其基因表达中国矫形外科杂志2 0 0 0 ，7 ；1 1 9 6 1 1 9 8 5 2 1 0 刘成龙，等脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶基因表达变化的试验研究，2 0 0 12 1 ；3 2 7 3 2 8 11 D a w s o nV L D a w s o nT M ，L o n d o nE D ，e ta 1 N i t r i co x i d em e d i -a t e sg l u t a m a t en e u r o t o x i e i t yi np r i m a r yc o r t i c a lc u l t u r e M P r o cN a t lA c a dS c iU S A ，1 9 9 1 ，8 8 ；63 8 6 63 7 1 1 2 严兵，周初松，刘平，等脊髓伤后脊髓组织中一氧化氮合酶 活性变化与兴奋性氨基酸释放间的联系 J 现代康复2 0 0 0 ，4 ( 1 2 ) ：1 8 3 8