蛋白质的 分离纯化和表征 一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质分子的大小和空间结构 三、蛋白质的胶体 性质与蛋白质的沉淀 四、蛋白质分离纯化的一般原则 五、蛋白质的分离纯化方法 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质分子的大小和空间结构蛋白质分子量很大，相对分子量变化范围在6000-1000000或更大一些。测定蛋白质分子量的方法：1.根据蛋白质化学组成测定最低相对分子量2.渗透压法测定相对分子量3.蛋白质的扩散和扩散系数4.沉降分析法测定蛋白质相对分子量5.凝胶过滤法测定相对分子量6.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子量蛋白质有四级结构肽链中各种氨基酸相互联接的顺序是蛋白质的初级结构 ，也叫一级结构。多肽链主链骨架中的若干肽段，通过氢键，形成有规则 的构象，这称为二级结构。-螺旋 -折叠 无规线团在二级结构的基础上，多肽链间通过氨基酸残基侧链的 相互作用而进行盘旋和折叠，因而产生的特定的三维空间结 构，这称为三级结构，也称为蛋白质的亚基。各个亚基在低聚蛋白中的空间排布及相互作用，称为蛋 白质的四级结构。蛋白质的生理活性是由二级、三级、四级结构来决定的。三、蛋白质的胶体性质与 蛋白质的沉淀 （1）蛋白质的胶体性质 （2）蛋白质的沉淀分散相质点在胶体系统中保持稳定，需要具备3个条件：第一，分散相的质 点大小在1100nm范围内，这样大小的质点在动力学上是稳定的，介质分子 对这种质点碰撞的合力不等于零，使它能在介质中作不断的布朗运动(Brown movement)；第二，分散相的质点带有同种净电荷，互相排斥，不易聚集成大 颗而沉淀；第三，分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层，例如与水形成水化 层(hydration mantle)，质点有了水化层，相互间不易靠拢而聚集。（1）蛋白质的胶体性质 蛋白质的分子大小属于胶体质点的范围。 蛋白质溶液是一种亲水胶体，蛋白质分子表面的亲水基团，如一NH2，- COOH,-OH以及 CO-NH-等，在水溶液中能与水分子起水化作用，使蛋白 质分子表面形成一个水化层，每克蛋白质分子能结合0.30.5克水。 蛋白质分子表面上的可解离基团，在适当的pH条下都带有相同的 净电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。 蛋白质溶液由于具有水化层 双电层两方面的稳定因素，所以作为 胶体系统是相当稳定的，如无外界因素的影响，就不致互相凝集而沉淀 。 蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁达尔效应、布朗运动以及 不能通过半透膜。（2）蛋白质的沉淀蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质溶液 的稳定性既然与质点大小、电荷和水化作用有关，那么很自然，任何影响 这些条件的因素都会影响蛋白质溶液的稳定性。 盐析法 有机溶剂沉淀法 重金属盐沉淀法 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 加热变性沉淀法 盐析法 盐析法向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸胺、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐后，复可溶解。 有机溶剂沉淀法 向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂（甲醇、乙醇或丙酮等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。有机溶剂沉淀法，如果控制在低温下操作并且尽量缩短处理的时间则可使变性速度减慢。重金属盐沉淀法 当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，这样它就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救就是因为它能和重金属离子形成不溶性盐，然后再服用催吐剂排出体外。重金属盐常能使蛋白质变性，这可能是因为重金属盐水解生成酸或碱的缘故。 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如骤酸也称单宁酸苦味酸即2，4，6-三硝基酚，钨酸和碘化钾等。 某些酸类指的是三氯醋酸，磺基水杨酸和硝酸等。当溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂和酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。这类沉淀反应经常被临床检验部门用来除去体液中干扰测定的蛋白质。加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性是蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态。我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤（含MgCl2 )的制豆腐的方法，这是成功的应用加热变性沉淀蛋白质的一个例子。四、蛋白质分离纯化的一般原则 1.前处理 2.粗分级分离 3.细分级分离 动物材料应先剔除结缔组织 和脂肪组织； 种子材料应先去壳甚至去种 皮以免受单宁等物质的污染 ，油料种子最好先用低沸点 的有机溶剂如乙醚等脱脂。 然后根据不同的情况，选择 适当的方法，将组织和细胞 破碎。动物组织和细胞可用 电动捣碎机 或匀浆器破碎 或用超声波处理破碎。 1.前处理 植物组织和细胞，由于具有由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。 细菌整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波震荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）等。组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤等方法除去。 如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。2.粗分级分离 当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大既能除去大量杂质（包括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法（如聚乙二醇浓缩法）进行浓缩。3.细分级分离结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。 一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。五、蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小不同的纯化方法 （二）利用溶解度差别的纯化方法 （三）根据电荷不同的纯化方法 （四）利用选择性吸附的纯化方法 （五）利用配体的特异性亲和力的纯化方法 （一）根据分子大小不同的纯化方法 1.透析和超滤 2.密度梯度离心 3.凝胶过滤1.透析和超滤半透膜袋蛋白质溶液 透析液磁棒 磁力搅拌器 透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质 和其它小分子物质如无机盐单糖 等分开。常用的半透膜： 玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane paper）火绵纸（赛璐玎纸, celloidin paper） 其他改型纤维素材料超过滤（ultrafiltration ）利用压力、抽滤（A）或离 心力（B）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透 膜，而蛋白质被截留在膜上， 以达到浓缩和脱盐目的。滤膜 有多种规格，可选择性的截留 相对分子量不同的蛋白质。为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用截向 流过滤的方法，即液体在泵驱 动下沿着与膜表面相切方向流 动，在膜上形成压力，使部分 液体透过膜，而另一部分液体 切向地流过表面将被膜截留的 蛋白质分子冲走。滤膜 抽气滤膜离心AB2.密度梯度离心法（density gradient）生物大分子及颗粒的沉降不仅 决定于它的大小，而且也取决于 它的密度。颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大 的颗粒沉降的快，并且每种蛋白 质颗粒沉降到与自身密度相等的 介质密度梯度时，即停止不前， 最后各自在离心管中被分离成独 立的区带。分成区带的样品可以 在管底刺一个小孔逐滴放出，分 步收集。常用的介质有蔗糖、氯 化铯等。滴加样品离 心 管蔗糖密度梯度蔗糖浓度3.凝胶过滤原理： 凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分子筛层析。它是60 年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大小（直径）和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。应用 测定分子量分子筛层析原理示意图分 子 筛 层 析 与 洗 脱 曲 线凝胶颗粒收 集 蛋 白 质 管蛋白质混合物大分子从柱上面加缓冲溶液小分子洗脱体积（Ve）凝胶柱大分子小分子Ve1Ve2V0蛋白质Mr=49,000洗出 液中 的蛋 白质 浓度洗脱体积（mL）未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系Andrews的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白球蛋白MrMr“ “ 选择性曲线选择性曲线 ” ” G-200G-100logMrKav（二）利用溶解度差别的 纯化方法 1.等电沉淀和PH控制 2.蛋白质的盐溶和盐析 3.有机溶剂分级分离 4.温度对蛋白质溶解度的影响1.等电沉淀和PH控制蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电 斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。 在等电点以上或以下的pH时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而相互排 斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。在其等电点(pH 5.2- 5.3)时达到最低值，在等电点两侧的pH下，其溶解度迅速上升；不同的蛋 白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以 把蛋白质混合物分开。当pH被调至蛋白质混合物中某种成分的等电点pH时，这种蛋白质的大部分 或全部将沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中 这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓 度的盐溶液中。2.蛋白质的盐溶和盐析 低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶(salting in), 盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。表明中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。3.有机溶剂分级分离 （1）有机溶剂可以使蛋白质沉淀 主要有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。 （2）有机溶剂可以破坏水化膜、造成一个低介电区。 （3）有分级分离现象 （4）要求对有机溶剂低温预冷。4.温度对蛋白质溶解度的影响 在一定温度范围内，约0-40之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，例如人的血红蛋白从0到25，溶解度随温度上升而降低。在4