1不同提取方法赶黄草提取物清除 DPPH 自由基的作用研究作者：贺晓华，许龙，谈满良，杜方麓，曾建国【摘要 】 目的研究赶黄草提取物对 DPPH 自由基的清除作用。方法采用不同溶剂、不同提取方法制得赶黄草提取物，以抗坏血酸为对照，研究其对 DPPH 自由基的清除作用。结果不同溶剂提取物对 DPPH 自由基清除率强弱依次为 95 %乙醇水丙酮，不同极性部分对 DPPH 自由基清除率强弱依次为醋酸乙酯部分 正丁醇部分水部分石油醚部分，赶黄草提取物浓度达到一定浓度后与抗坏血酸对 DPPH 自由基清除能力相当。结论回流提取法是最适合提取赶黄草中有效成分的方法，赶黄草 95 %乙醇回流提取物具有良好的清除 DPPH 自由基的能力，醋酸乙酯部分清除 DPPH自由基能力最强。 【关键词】 赶黄草； DPPH 自由基； 清除率Abstract：ObjectiveTo study the extracts from Penthorum chinense Pursh on scavenging DPPH free radical. MethodsThe DPPH scavenging activities of Penthorum chinense Pursh extracted by different methods and different 2solvents were studied and compared with that of ascorbic acid. ResultsThe scavenging activity was decreased in the order of Penthorum chinense Pursh extracts obtained from 95 % ethanolwateracetone, and Polar different parts on DPPH free radical strong scavenging activity were part of ethyl N-butanol water petroleum ether. Penthorum chinense Pursh extract and ascorbic acid in a certain concentration had the same DPPH free radical scavenging activity.ConclusionThe reflux is the best method, 95 % ethanol extract has good activity to scavenge the DPPH free radical, and ethyl acetate the most strong seavenging activity to DPPH free radical.Key words： Penthorum chinense Pursh; DPPH free radical; Scavenging activity赶黄草为虎耳草科扯根菜属 Penthorum Gronvexl 植物扯根菜Penthorum chinense Pursh 的干燥地上部分1 。赶黄草为苗族民间的草药，主要分布于四川、贵州、湖南等地，具有清热解毒、退黄利湿、活血散瘀、利水消肿之功效2 。赶黄草中含有黄酮、有机酸、挥发油等成分，其中没食子酸和槲皮素为赶黄草中有效成分3 ，具有抗乙肝病毒和保肝的作用。对于赶黄草清除 DPPH 自3由基的活性研究及其抗氧化研究尚未见报道。衰老、癌症及炎症等疾病与体内脂质过氧化和自由基有直接关系，因为自由基可与生物体内的许多物质如脂肪酸、蛋白质等作用，夺取它们的氢原子，造成相关细胞的结构与功能的破坏，更重要的是其氧化产物和中间产物会伤害生物膜、酶、维生素、蛋白质及活细胞功能，其中一些还被认为是致癌物质，因此对消除自由基的探讨已得到普遍关注4 。清除自由基的检测方法很多，如电子顺磁共振法、电子自旋共振法、化学发光法等，但这些方法大多需用昂贵的仪器，一般实验室难以应用。DPPH 分析法是一种筛选自由基清除剂，评价抗氧化活性的简便方法5 。当有自由基清除剂存在时，由于其与 DPPH 中电子配对使 DPPH 液吸收逐渐消失，DPPH 液褪色程度与配对电子数成化学计量关系，因而可用分光光度法进行定量分析。为了了解赶黄草的抗氧化性质，进而阐明其所具有的抗病毒保肝作用机制，本文对赶黄草提取物清除 DPPH 自由基的活性进行了研究。1 仪器与试剂双光束紫外可见分光光度计 TU-1901(北京普析通用仪器有限公司)，电子天平( 梅特勒 -托利多仪器有限公司)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱 (北京市永光明医疗仪4器厂)，超声清洗仪 (昆明市超声仪器有限公司) ，数显恒温水浴锅(江苏省荣华仪器制造有限公司)。二苯基苦味酰基苯肼(DPPH) ，购自 sigma 公司。供试药材赶黄草 2007-10 下旬采自湖南浏阳，由湖南中医药大学周日宝教授鉴定为虎耳草科植物赶黄草 Penthorum chinense Pursh。2 方法2.1 赶黄草有效成分的提取2.1.1 回流提取法准确称取药材 10.0 g，加入 10 倍量的溶剂，回流提取 2 h，重复两次，将提取液过滤，滤液真空浓缩至浸膏，干燥待用。2.1.2 超声提取法准确称取药材 10.0 g，加入 10 倍量的溶剂，加热超声 2 h，重复两次，将提取液过滤，滤液真空浓缩至浸膏，干燥待用。2.1.3 温浸法准确称取药材 10.0 g，加入 10 倍量的溶剂，5温浸 2 h，重复两次，将提取液过滤，滤液真空浓缩至浸膏，干燥待用。2.1.4 不同极性溶剂萃取法准确称取药材 50.0 g，以“2.1.1”方法用 75 %乙醇提取两次，提取液经真空浓缩至小体积，依次用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取，所得各萃取部分浓缩成浸膏，干燥待用。2.2 赶黄草提取物清除 DPPH 自由基能力的测定2.2.1 清除率的测定精密称取 8.0 mg DPPH 于 50 ml 容量瓶中，用 95 %乙醇溶解；样品溶解于 95 %乙醇溶液中。取样品溶液 1 ml 加入到离心管，再加入 3 ml 的 DPPH 溶液配成样品溶液。95 %乙醇溶液 1 ml 加入到离心管，再加入 DPPH 溶液 3 ml 配成未加样品液的 DPPH 溶液。取样品溶液 1 ml 加入到离心管，再加入 3 ml 的 95 %乙醇配成样品空白溶液。上述溶液在室温下离心 20 min 后用紫外分光光度计在 517 nm 下检测。测定样品溶液吸光度Ai，未加样品液的 DPPH 溶液吸光度 Ac，样品空白溶液吸光度Aj。根据下列公式计算清除率：清除率= 1（AiAj）Ac100%62.2.2 半清除率的测定抗氧化剂清除自由基能力采用清除DPPH 的半清除率（IC50 值）表示。将待测液配制成不同浓度溶液，测定 DPPH 自由基清除率，并绘制 DPPH 自由基清除率对待测液浓度曲线，由曲线读取或用方程计算出 DPPH 自由基清除率为 50 时所需赶黄草提取液浓度，计算出赶黄草提取液中溶质质量，按公式计算 IC50 值。溶质质量所需浓度越低，表明半清除率越高。IC50=50 消耗的 DPPH 质量加入的试样溶液中溶质的质量3 结果3.1 DPPH 吸收光谱与测定波长的确定 DPPH 在溶液中具有典型紫红色，当它与能提供 1 个电子的自由基清除剂作用时，生成浅色产物，使溶液的典型紫红色变浅。测定 DPPH 溶液在200 600 nm 之间的光谱图，由图 1 可知，DPPH 溶液在醇- 水体系中其 327 nm 和 517 nm 处吸光度都具有极大值，但 517 nm 处的极大值在加入槲皮素后降低较显著，故选用在 95%乙醇体系下517 nm 处 DPPH 含量的变化来进行测定。3.2 DPPH 溶液稳定性实验测定 DPPH 在 95 %乙醇中吸光度变化与时间的关系，结果显示 DPPH 的吸光度在 40 min 内基本不变。加入样品后，测定吸光度与时间的关系，发现吸光度随时间增长呈线性降低，但 30 min 后，吸光度的变化已经很小。结果见图 2。为7了提高测试准确度，在加入样品反应 20 min 后，迅速测定吸光度。3.3 抗氧化剂浓度与其清除 DPPH 的关系抗坏血酸、没食子酸和槲皮素是常见的抗氧化剂6 ，配制槲皮素、抗坏血酸、没食子酸标准溶液，逐级稀释使用。按“2.2.1”方法测定，图 3 可见抗氧化剂浓度在一定范围内，随着浓度的增高，清除 DPPH 自由基的能力逐渐增大。各抗氧化剂浓度与清除率之间线性方程分别表示如下，槲皮素：Y=1.273 6103C+5.715 7，R2=0.995 9；没食子酸：Y=0.967 1103C+9.561 4，R2=0.986 0；抗坏血酸：Y=1.073 6103C+3.981 4，R2=0.985 5。可见，在一定范围里，可以用清除率来表示抗氧化剂 SPPH 自由基的清除能力。从图 3 曲线可知，采用清除率极大值点或其他特征点所对应的抗氧化剂含量来比较 DPPH 自由基清除能力的方法比较合理。由于极值点测定比较困难，误差较大，而自由基清除率在 50%时对应的点较容易在曲线上标定，因此选定抗氧化剂的自由基半清除率 IC50值为测定指标。采用该法测定的槲皮素、抗坏血酸、没食子酸的IC50 为 6.56，5.32，5.45。结果见图 4。3.4 不同提取方法清除 DPPH 自由基的能力按“2.1.1” ，“2.1.2”， “2.1.3”不同方法提取，使用相同溶剂得到提取物，逐级稀释，按“2.2.1” 方法测定，结果见图 5。8不同提取方法得到的提取物都具有一定的清除自由基的能力，在一定浓度范围内，呈现正向变化，但随着浓度增加到一定值后，清除率趋于平缓。回流提取得到的提取物的 IC50 为 2.15，超声提取得到的提取物的 IC50 为 1.82，温浸提取得到的提取物的 IC50 为1.52，回流提取得到的提取物的 IC50 最高。3.5 不同溶剂提取物清除 DPPH 自由基的能力按“2.1.1”回流提取法分别用 95 %乙醇，水，丙酮提取，逐级稀释，按“2.2.1”方法测定。结果见图 6。3 种溶剂提取物都具有一定的清除自由基活性的能力，且随着提取物浓度增加，清除率逐渐增高，但随着浓度增加到一定值后，清除率趋于平缓。在浓度范围内，赶黄草 95 %醇提物的 IC50 为2.28，水提物的 IC50 为 1.66，丙酮提取物的清除能力最弱，IC50为 1.30。其差异可能是因为溶剂的极性不同，使其对赶黄草中抗氧化活性物质的溶解度不同，所提取的抗氧化物质的总量和种类也就不同，导致了不同溶剂提取液的清除 DPPH 自由基能力不同。3.6 不同极性部分清除 DPPH 自由基的能力根据实验结果，选择回流提取法，按“2.1.4”方法将提取液萃取为极性不同的 4 个部分：石油醚部分，醋酸乙酯部分，正丁醇部分以及水部分。按方9法“2.2.1” 测定。结果见图 7。从图 7 看出，在 4 个不同的极性部分中，清除 DPPH 自由基能力最强的部分是醋酸乙酯部分。赶黄草有效成分主要是黄酮化合物如槲皮素等存在于该极性部分，表明赶黄草中黄酮化合物具有较强的清除自由基的能力。3.7 与抗坏血酸的清除自由基能力比较抗坏血酸是常用的抗氧化剂，将乙醇提取物按不同浓度用“2.2.1”项下方法测定，与相应浓度抗坏血酸比较，由图 8 可知，赶黄草乙醇提取物的清除自由基能力在达到一定浓度后接近抗坏血酸用的水平。4 结论回流提取法是最适合提取赶黄草中有效成分的方法，其具有操作简单，方法稳定的特点。赶黄草提取物均具有清除 DPPH 自由基的作用， 9