低氧对大鼠脂肪代谢的影响 及组织作用靶点的研究学校代码：1 0 0 2 3学号：2 0 0 2 0 1 1 0 9专业年级北京协和医学院临床医学专业2 0 0 5 级姓名：刘赫导师：史轶蘩( 教授)导师组成员：朱惠娟( 副教授)潘慧( 教授)龚凤英( 副研究员)北京协和医学院临床学院内分泌科完成日期2 0 1 3 年6 月目录I U ll II I II II lll llI IIIl Y 2 3 8 0 9 5 0英文缩略词3中文摘要4英文摘要。7前言1 1材料与方法1 4一、实验材料1 4二、研究对象。1 5三、实验方法1 5实验结果。2 4讨论4 2结论。5 0参考文献5 1绢；述5 6低氧与脂肪代谢的关系及研究进展5 6驾【谢6 3独创性声明6 4英文缩略词O S A H So b s t r u c t i v es l e e pa p n e a - h y p o p n e as y n d r o m eA S mT N F 0 【I L 6C R PH M W A P NP A I 1A 咿KR O SN F 1 c BP P A R 吖H I F 1C V DT GC H OL D L CH D L CF F AE L I S AP C RR N a s eR n a s eI U 、- P C RS DH O 1V E G FM C P 1a t h e r o s c l e r o s i si n s u l i nr e s i s t a n c et m o rn e c r o s i sf a c t o r - a l p h ai n t e r l e u k i n 6C - r e a c t i v ep r o t e i nl l i g hm o l e c u l a rw e i g h ta d i p o n e c t i np l a s m i n o g e na c t i v a t o ri n h i b i t o r - 1 A M Pa c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s er a c t i v eo y g e na e c i e sn u c l e a rf a c t o r - k a p p aBp r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r - a c t i v a t e dr e c e p t o r - g a m m ah y p o x i ai n d u c i b l ef a c t o r - 1c o r o n a r yv a s c u l a rd i s e a s et i g l y c e r i d ec h o l e s t e r 0 1l o wd e n s i t yl i p o p r o t e i nc h o l e s t e r o ll l i g hd e n s i t yl i p o p r o t e i nc h o l e s t e r o lf r e ef a t t ya c i d sE n z y m eL i n k e dI m m u n o s o r b e n tA s s a yP o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nR i b o n u c l e a s eR i b o n u c l e a s eI n h i b i t o rR e v e r s et r a n s c r i p t i o nP C Rs t a n d a r dd e v i a t i o nH e m eo x y g e n a s e - 1v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o rm o n o c y t ec h e m o a t t r a c t a n tp r o t e i n l3阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征动脉粥样硬化胰岛素抵抗肿瘤坏死因子0 【白介素6C 反应蛋白高分子量脂联素纤溶酶原激活物抑制物1A M P 依赖的蛋白激酶活性氧核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体低氧诱导因子1冠心病甘油三酯胆固醇低密度脂蛋白胆固醇高密度脂蛋白胆固醇游离脂肪酸酶联免疫吸附试验聚合酶链式反应R N A 酶R N A 酶抑制剂反转录P C R标准差血红素加氧酶1血管内皮生长因子单核细胞粘附因子1目的中文摘要低氧对大鼠脂肪代谢的影响及组织作用靶点的研究低氧是临床许多疾病共同的病理生理因素，长期慢性低氧对机体的损害是多方位的，其对机体的危害逐渐引起人们的重视。研究发现慢性低氧时机体可表现为脂肪代谢异常，其机制与低氧影响血脂在肝脏内代谢的关键酶有关。而脂肪代谢紊乱是动脉粥样硬化和冠心病的首要独立危险因素，肥胖、脂肪代谢紊乱以及心血管疾病三者之间存在密切联系。目前，国内外对低氧对脂代谢影响的研究很少，且多集中在对细胞损伤及相关适应机制方面，缺乏整体水平的观察，尤其是慢性持续性低氧，未见类似研究报道。本实验意在模拟体内低氧状态，在整体水平上探讨低氧对大鼠体重、血糖及血脂的影响，在组织水平上，检测肝脏、脂肪组织及骨骼肌中低氧和脂代谢相关基因m R N A 的变化，观察目的基因在不同靶器官中表达的差异，进而了解低氧与脂肪代谢的关系，初步探讨复氧后上述病理变化的恢复情况及可能机制，寻找对低氧刺激敏感的靶器官及指标，为疾病的早期诊断、早期干预提供新的思路及实验依据。方法选取3 周龄雄性w i s t a r 大鼠5 6 只，随机分为三大组，7 小组，每小组8 只。分别为：常氧3 ( 常氧3 周后处死) 、低氧3 ( 低氧3 周后处死) 、常氧6 ( 常氧6周后处死) 、低氧6 ( 低氧6 周后处死) 、复氧6 ( 低氧3 周后转常氧恢复3 周后处死) 、常氧1 2 ( 常氧1 2 周后处死) 和复氧。1 2 ( 低氧6 周转常氧恢复6 周后处死)低氧处理结束后，测量所有大鼠体重、血糖、血脂及血清高分子量脂联素和白介素6 水平；取大鼠肝脏、皮下脂肪、棕色脂肪、内脏脂肪和骨骼肌组织应用实时荧光定量R T - P C R 方法，检测实验6 周三组大鼠上述组织中低氧及脂代谢相关基因m R N A 的变化。结果1 实验3 周时，低氧3 组大鼠血红细胞计数( 7 1 8 + 0 4 1V S6 5 2 + 0 2 9 1 0 1 2 L ，P 6 w ) 引起空腹血糖水平降低，而不影响糖耐量和胰岛素的敏感程度1 4 5 1 。对大鼠血脂检测结果进行统计分析，结果提示低氧组大鼠血总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇水平较常氧组明显降低，而低密度脂蛋白胆固醇和游离脂肪酸则较常氧组显著升高。经过复氧处理后，恢复组大鼠总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和游离脂肪酸均可完全恢复至常氧水平( 表6 8 和图5 8 ) 。其中L D L C 、H D L C 和F F A 的结果与文献报道的O S A H S 患者血脂谱异常趋势一致，而C H O 和T G 的结果则与之相反。可能原因为，鼠系为天然抗高血脂和抗动脉硬化动物，本实验中，我们均以普通饲料喂养大鼠，大鼠难以形成高甘油三酯血症及高胆固醇血症；此外持续性低氧3 周至6 周干预时间较短，有待进一步延长实验时间观察C H O 及T G 变化。高脂蛋白血症是动脉粥样硬化的独立危险因素，在糖尿病、冠心病及高脂蛋白血症患者的血液循环中L D L C 的浓度显著升高。天然L D L 与轻度氧化修饰的L D L 能刺激内皮细胞产生一系列依赖N F r B 的趋化因子和粘附分子。单核细胞暴露于氧化L D L ，在单核细胞内发生氧化产生细胞内活性产物，细胞活化后产生的各种趋化因子、生长因子，通过刺激局部巨噬细胞增殖和新的单核细胞，产物可以激活I r B 使其降解，N F r , B 发生核移位，诱导靶基因表达。B e r t i l e 等1 4 6 1 发现轻度氧化损伤的L D L 可以激活N F r B 的核位移，促进致动脉粥样硬化的化学细胞因子的转录、合成、分泌。长期重度修饰的L D L 则抑制了N F r B 的活性。人体内L D L 可以通过以下两种方式进行氧化：动脉内皮细胞可以在氧自由基的介导下经细胞内脂加氧酶作用，使L D L 氧化修饰；过度金属离子( 如C u 2 + 、F e 2 + )同样可以在氧自由基介导下，使脂蛋白卵磷脂分子中的多不饱和脂肪酸( P U F A s )产生脂过氧基诱导的氧化修饰。经氧化修饰后的低密度脂蛋白胆固醇其理化性质发生一系列改变：生成大量脂质过氧化物( 氧化脂酸，氧化磷脂和氧化固醇) ，同时低密度脂蛋白受体识别位点改变，产生氧化低密度脂蛋白胆固醇( o x i d a t i v e l ym o d i f i e dL D L ，O X L D L ) 的自身受体结合位点，所以氧化修饰后的L D L 不经L D L受体代谢，而是由氧化低密度脂蛋白胆固醇自身受体识别、结合、内吞饮入细胞，引起内皮细胞结构及功能改变。有研究表明，血液中L D L 的增加并不会导致细胞中胆固醇的大量堆积，是因为L D L 经由L D L 受体摄入细胞具有负反馈机制，但L D L 被氧化修饰后则可经由A 型清道夫受体摄入细胞，这种摄入不受O X L D L 水平的影响。许多文献报道，o x - L D L 可增加巨噬细胞摄入L D L 的速度，导致胆固醇在巨噬细胞内的蓄积并转变为泡沫细胞。而泡沫细胞是A S 的早期变化和特征性标志，最终形成脂质条纹。所以认为O X L D L 对A S 的发生发展有促进作用。K o r b i n i a nb r a n d 等发现，O X L D L 可引起动脉粥样斑块中巨噬细胞和平滑肌细胞中N F r d 3 调节的紊乱。不饱和脂肪酸具有前氧化特性，能使细胞产生氧化应激。D i c h t l 等【4 7 】用实验证实了6 脂肪酸亚油酸酯能活化内皮细胞N F r B ，刺激培养的人血管内皮细胞表达血管细胞粘附因子1 ( v a s c u l a rc e l la d h e s i o nm o l e c u l e 一1 ，V C A M 1 ) ，并明显增加T N F 旺引起的I L 6 的表达，导致血管内皮细胞的炎症及损伤。而血管内皮细胞的激活与功能异常是A S