1人源胸腺素 原和白介素 2 融合蛋白的基因克隆与原核表达【摘要】 目的 克隆人胸腺素 原/白介素 2 融合基因，构建其原核表达载体并在大肠杆菌系统中有效表达。方法 采用 RTPCR 方法，从人白血病细胞和人 T 淋巴细胞中分别扩增得到胸腺素 原/白介素 2 基因，利用基因重组技术将融合基因片段重组于 pET42a原核表达载体上，构建成 pET42aPI。经酶切、测序鉴定后，将重组质粒转化大肠杆菌 Rosseta，IPTG 诱导蛋白表达。表达产物经离子交换和分子筛纯化后进行 Western blot 分析，通过人外周血单核细胞玫瑰花结实验对融合蛋白进行了初步的活性测定。结果 凝胶电泳显示 PCR 产物的长度约 750 bp，测序结果表明，扩增片段与预期序列一致。重组菌在 IPTG 诱导下表达相对分子质量为 28 kDa的蛋白，纯化后的融合蛋白能提高人外周血单核细胞玫瑰花结形成率，表明具有一定活性。结论 成功克隆和构建了人胸腺素 原/白介素 2 融合基因的原核表达载体，并在原核表达系统中得到有效表达。 【关键词】 胸腺素 原；白介素 2；融合蛋白；表达Abstract:Objective To clone human prothymosin and interleukin2 fusion gene into the prokaryotic expression 2vector and to express the fusion protein effectively in E.coli system.Methods The human prothymosin and interleukin2 gene were amplified by RTPCR from human leukemia cells and T lymphocytes respectively. The two genes were fused with a linker and the fusion gene fragment was used to construct a prokaryotic expression vector pET42aPI by DNA recombinant technique. After identification by restriction analysis and DNA sequencing, the recombinant plasmid was transformed into E.coli Rosetta. The overexpressed protein induced by IPTG was purified by anion exchange chromatography and Sephacryl S200 chromatography. The biological activity of the fusion protein was assayed using T cell Erosette formation test of human blood. Results The PCR product was about 750 bp in length, which was consistent with the expected size of the fusion gene. Plasmid pET42aPI was transformed into Rosetta and a new protein with a relative molecular weight of 28 kDa was expressed. The purified fusion protein could increase the Erosette formation rate of human peripheral mononuclear cells.Conclusion The encoding sequence of human prothymosin and interleukin2 fusion gene was successfully cloned into the prokaryotical expression vector 3pET42a and can be expressed effectively in E.coli system.Key words:prothymosin ; interleukin 2; fusion protein; expression人源胸腺素 原(prothymosin ， proT)是由 109 个氨基酸组成的一种小分子酸性蛋白。它具有多种不同的生物学活性，主要是促进细胞增殖和具有免疫调节剂的作用1-3 。胸腺素 原作为细胞外信号蛋白，对细胞凋亡起调节作用，在细胞凋亡抑制剂的协同下可预防脑部中风4 。Skopeliti 等5在外周血单核细胞的培养过程中加入 proT，培养液中检测到 IL1 及其受体、hsp90等多种蛋白的过度表达，而产生的 IL1 可激活 T 细胞受体而促进T 细胞增殖和 IL2 的产生。人白细胞介素 2 (Interleukin2, IL2) 是由 133 个氨基酸组成的多肽。Burchill 6等人研究发现 IL2和 IL2R(IL2 受体) 主要是调整 T 细胞生长和维持 T 细胞的稳定。IL2 可缩短脑脊髓炎自身免疫过程并增强荷瘤鼠的免疫调节作用，对因移植性或化学方法诱发的肿瘤产生治疗效果7 。IL2 还能提高 NK 细胞（自然杀伤细胞）和 LAK 细胞（淋巴因子激活的杀伤细胞）的活性，可以用于治疗癌症，但是过度使用 IL2 会带来不良反应。IL2 和 proT 协同作用于自体肿瘤的反应比单独使用 IL2 所引起的反应要强8,9 。IL2 和 proT 的联合使用不仅能降低单独使用 IL2 产生的毒副作用，而且还能够提高抗肿瘤的效果8,10 。4因此，本研究将 IL2 和 proT 进行融合，并引入柔性连接肽Linker，构建了 proT/IL2 融合蛋白的原核表达载体pET42aPI，并在大肠杆菌系统中得到了有效表达，为进一步研究该融合蛋白的功能奠定基础。1 材料与方法1.1 材料菌种 Rosetta(DE3)、载体 pET42a 由本实验室保存。RNA 提取试剂盒：Qiagen 公司， RTPCR 试剂盒、限制性内切酶 Nde I 和Xho I、T4DNA 连接酶、DNA Fragment Quick Purification/Recover Kit 购自大连宝生物公司，HRP 兔抗羊酶标二抗购自 Sigma 公司，人 HL60 白血病细胞购自中山大学，HitrapTM Q 阴离子交换柱、Sephacryl S200 购自安玛西亚公司，其他试剂均是进口或国产的分析纯试剂。1.2 方法1.2.1 引物设计将白介素 2 融合于胸腺素 原的羧基端，为保持两者的活性，5在两者之间放入一段连接肽，连接肽的组成：SGGGGS。proT 基因的克隆：上游引物：P1：5CCAGGATCCCATATGTCA GACGCAGCCGTAG3；下游引物：P2：5ACTAAG CTTTTAGTCATCCTCGTCGGTCTTC3。IL2 基因的克隆：上游引物：P3：5GTCGGATCCATGGCACCT ACTTCAAGTTCTACAAAGAA3；下游引物：P4：5CCAGGCTCGAGTTAAGTTAGTGTTGAGATGATGC TTTG3。proT/IL2 融合基因的克隆：上游引物：P5：5TTCTTTGTAGAACTTGAAGTAGGTGCAGAG CCACCGCCACCCGAGTCATCCTCGTCGGTCTTCT3，下游引物：P6：5AGAAGACCGACGAGGATGAC TCGGGTGGCGGTGGCTCTGCACCTACTTCAAGTT CTACAAAGAA3。其中，引物 P1 和 P4 分别引入了限制性酶切位点 Nde I 和 Xho I。1.2.2 目的基因的 PCR 扩增用引物 P1 和 P2 从人 HL60 白血病细胞中进行 RTPCR 克隆出 proT 基因；用引物 P3 和 P4 从人 T 淋巴细胞中进行RTPCR 克隆出 IL2 基因；以 IL2 DNA 片段为模板，用引物 P3和 P5 进行 PCR，获得 linkerIL2；以 proTDNA 片段为模板，6用引物 P4 和 P6 进行 PCR，获得 linkerproT；用 linkerIL2和 linkerproTDNA 片段以 11 混合作为模板，用引物 P1 和P6 进行 PCR，扩增出融合基因 proTlinkerIL2 DNA 片段（PI） 。每步 PCR 都包含相应的模板和上下游引物、Tag 聚合酶、dNTPs ，PCR 仪设定的扩增条件：先在 94 变性 5 min ，再于94 1 min，58 1 min ，72 1 min 进行 30 个循环，最后于72 延伸 10 min，PCR 结束后，取 1 L 反应液进行 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 结果。PCR 产物用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后，DNA 回收试剂盒回收纯化。1.2.3 重组质粒 pET42aPI 的构建及鉴定用限制性内切酶 Nde I、Xho I 对经试剂盒纯化后的 PCR 产物和表达载体 pET42a 进行双酶切，酶切完毕， 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，切下胶中所需片段，以 DNA Fragment Quick Purification/Recover Kit 回收。酶切后的 PCR 产物与回收后的载体用 T4DNA 连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌 Rosseta，将重组菌 Rosseta/pET42aPI 涂布于含有 35 g/mL 氯霉素和 100 g/mL 卡那霉素的 LB 琼脂平板，挑取阳性单克隆，置含相应抗生素的 LB 培养液的试管中 37 振摇过夜，用碱裂解法小量制备质粒DNA，获取的质粒分别用 Nde I 和 Xho I 单、双酶切，10 g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定，质粒进行 DNA 测序鉴定。71.2.4 融合蛋白的诱导表达将鉴定正确的阳性克隆菌株 Rosseta/pET42aPI，接种到含有35 g/mL 氯霉素和 100 g/mL 卡那霉素的 5 mL LB 培养基中，在 37 以 180 r/min 培养过夜，以 150 比例接种至含相应抗生素的 50 mL LB 中，在 37 ，180 r/min 条件下培养至 A600 为 0.40.5，用终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG 诱导蛋白表达。之后在同等条件下继续培养 4 h。取适量菌液在 4 条件下，5 000 r/min 条件下离心 5 min，菌体沉淀用 1 mL 细菌裂解液（50 mmol/L TrisHCl，pH=7.2，50 mmol/L NaCl）重悬。重悬液用超声法破碎细胞，裂解菌体再在 13 000 r/min 条件下离心 5 min。分别取菌体裂解上清液（可溶蛋白部分）和沉淀重悬液（不可溶蛋白部分）各 10 L，SDSPAGE 电泳分析蛋白表达情况。1.2.5 融合蛋白的纯化菌体经超声破碎后，4 ，13 000 r/ min，离心 10 min，取上清，用 0.22 m 低蛋白吸附的滤器过滤后上样。经阴离子交换柱粗纯（平衡缓冲液 50 mmol/L TrisHCl，pH