SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）测定蛋白质分子量一. 实验目的 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴。 熟悉蛋白印迹技术原理和方法二. 实验原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶 系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠） 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝 胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白 大小，形状和电荷)系统中加入一定量的十二烷基硫酸 钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋 白质的分子量大小SDS的作用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系 统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子 内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还 原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓 度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例 结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合 物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷 状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从 而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异， 由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在 进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度主要取决于分子大 小。二. 实验原理当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品的迁移率与 其分子量的对数呈线性关系。符合如下方程式：Lg MW =b m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可 获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据 它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。二. 实验原理 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和 不连续系统两大类。 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度 相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和 分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝 胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电 场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具 有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率 均较前者佳。Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200影响蛋白质和 SDS 结合的主要3个因素1）二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下， SDS 才能定量地 结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。般以巯基乙醇作还原剂 。在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新 氧化而形成蛋白质聚合体。 2）溶液中 SDS 的浓度：溶液中 SDS 的总量，至少要比蛋白质的量高 3 倍，一般需高达 10 倍以 上。当溶液中SDS单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重 量比为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结 合，它们的重量比应该为1:4或1:3。 3）溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过 0.26 ， 因为 SDS 在水溶液中是 以单体和分子团的混合体而存在， SDS 结合到蛋内质分子上的量，仅决定于 平衡时 SDS 单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中， SDS 单体 具有较高的平衡浓度。 三. 注意事项用SDS-PAGE测蛋白质Mr时应注意以下问题： 1 ). 如果蛋白质 -SDS 复合物不能达到 1.4 SDS lg 蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能 得到准确的结果。 2 ). 不同凝胶浓度适用于不同的 Mr范围， Weber 的实验指出，在 5% 的凝胶中， M r 为 25 000- 200 000 的蛋白质 ，其 Mr的对数与迁移率 呈直线关系；在 10 的凝胶中， M r 为 10 000- 70 000 蛋白质 ，其 Mr的对数与迁移率 呈直线关系；在 15 的凝胶中， Mr为 10 000-50 000 蛋白质，其 M r 的对数与迁移率呈直线关系； 3.33 ( 以上各种浓度的凝胶，其交联度 都是 2.6%) 的凝胶可用于 Mr更高的蛋白质。 3 ). 许多蛋白质，是由亚基 ( 如血红蛋白 ) 或两条以上肽链 ( 如胰凝乳蛋白酶 ) 组成的，它们在 SDS 和疏基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质， SDS- 凝胶 电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的 M r ，而不是完整分子的 Mr 。 为了得到更全面的 资料，还必须用其它方法测定其 Mr及分子中肽链的数目等，与 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳的 结果相互参照。 4 ). 不是所有的蛋白质都能用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其 Mr ，已发现电荷异常或构象异 常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质 ( 如某些糖蛋白 ) 以及一些结构蛋白（如胶原蛋白等） 用这种方法测定出的 Mr是不可靠的。如组蛋白 F 1 ，它本身带有大量正电荷，尽管结合了正 常量的 SDS ，仍不能完全掩盖其原有电荷的影响。它的 Mr是 21 000 ，但 SDS- 凝胶电泳测 定的结果却是 35 000 。因此，要确定某种蛋白质的分子量时，最好用两种方法互相验证，则 更为可靠。 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完 全打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合 到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用 SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还 原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白 质溶解而与SDS定量结合。 有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如 胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离 成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基 或单条肽链的MW。 已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异 常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白） 以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，往 往采取2种以上测定方法结合使用。目前其他常用测定相对 分子量的方法有： 聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量（ 有浓缩样品特点，可分次加样；不需解离亚基，适宜测定 球蛋白，而对纤维蛋白有误差。电泳需2000伏特小时） 凝胶层析法测定蛋白质相对分子量（特点方法简单，样 品用量少，而且有时不需纯物质，一般不引起生物活性物 质的变化。局限性是pH6-8的范围内，线性关系比较好， 但在极端pH时，蛋白质有可能因变性而偏离。）七 分析计算绘制标准曲线：按下式计算相对迁移率：(m R ) 以每个蛋白标准的分子量 对数对它的相对迁移率作图得标 准曲线，量出未知蛋白的迁移率 即可测出其分于量，这样的标难 曲线只对同一块凝胶上的样品的 分子量测定才具有可靠性。