质粒DNA 的提取及酶切内蒙古农业大学生物化学与分子生物学实验教学中心制作人：李国婧实验原理实验仪器实验试剂实验步骤注意事项实验原理在pH 12.0 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。 将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒 DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提 进一步纯化质粒DNA。限制性内切酶在一定的条件下对DNA特异序列进行切割。 实验仪器1 恒温培养箱2 恒温摇床3 台式离心机，最高转速14000g4 高压灭菌锅5 水浴锅6 电泳仪7 电泳槽实验试剂1溶液2溶液3溶液4结合缓冲液5浓缩漂洗液6洗脱缓冲液7离心吸附柱8废液收集管实验步骤（一）提取质粒1. 将2 mL 含Amp ( 50 gmL ）的LB 液体培养基加入到试管中，接人上述的含pTOP 质粒 的大肠杆菌，37 振荡培养过夜。2 取1.5 mL 培养物倒人微量离心管中,1200rpm/min 离心 1 min 3 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。4 将细菌沉淀悬浮于100L 溶液I中，充分混匀，vertex。5 加150L 溶液，立即温和颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变的清凉。随后将离心管放置冰上1-2min(时间勿超！) 6. 加人150L溶液，立即温和颠倒离心管数次，将离心管室温放置5 min 。12000rpm离心12min。7. 将420L结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤3中的上清加入离心吸附柱中（尽量去除杂质），混匀，12000rpm离心30s。倒掉废液收集管中的废液。8. 加入750L漂洗液于离心吸附柱中，静置1min后，12000rpm离心15s。倒掉废液收集管中的废 液。重复一次。倒掉废液后。再次于1200rpm/min 离心 2 min，尽量除去漂洗液。9 小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管中，加入50L无菌水，室温放置2-5min后，1200rpm/min 离心 1 min。 -20 保存。（二）酶切酶切反应体系（20L）:ddH2O 16L10Buffer R 2LHind 1L质粒 1LTotal 20L37 保温2h ，凝胶电泳观察实验结果 注意事项质粒检测：电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.71.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。