微流控芯片技术及其在检验医学中的应用 岳志红 张 正(北京大学人民医院检验科 北京 100044)摘 要 芯片实验室技术作为基因组学和蛋白质组学研究的一种新的技术平台,受到广 泛重视。其中微流控芯片可用于基因组学和蛋白质组学的各个领域,包括基因表达分析、 基因多态型分析和临床诊断等,可以完成样品的分离、 反应和分析等所有步骤。基于毛细 管电泳的微流控芯片技术可以更快地完成PCR产物分离。本文介绍微流控芯片技术的原理、 研究进展及其在检验医学中应用。 关键词 微流控芯片 毛细管电泳 检验医学经典实验室的规模正在缩小,最近出现的新名 词 “芯片实验室”(Lab - on - a - Chip)、“芯片工厂” (Factory - on - Chip)等证明这种发展趋势。芯片实验室是系统集成和微刻技术发展的结晶,是可以完 成生物化学分析的微型芯片。最完整形式的芯片实 验室可以完成样品的预处理、 分离、 稀释、 混合、 化学 反应、 检测以及产品的提取等所有步骤,因此也称为 微完 全 分 析 系 统(micro T otal Analytical System , TAS)。它不仅可以提高分析速度、 增加分析效率、 大大降低样品和试剂消耗,而且可使分析过程自动 化、 排除人为干扰、 防止污染以及完成自动高效的重 复实验。目前已进入检验医学的微流控芯片(Mi2crofluidic chip)是此项技术的代表。1 技术原理微型芯片根据其结构和工作机理可分为两大 类:微阵列芯片(Microarray chip)和微流控芯片。微 流控芯片采用类似半导体的微机电加工技术在芯片 上构建微流路系统,将实验与分析过程转载到由彼 此联系的路径和液相小室组成的芯片结构上。加载 生物样品和反应液后,采用微机械泵、 电水力泵和电 渗流等方法驱动芯片中缓冲液的流动,形成微流路, 于芯片上进行一种或连续多种的反应。激光诱导荧 光、 电化学和化学等多种检测系统以及与质谱等分 析手段结合的很多检测手段已经被用在微流控芯片 中,对样品进行快速、 准确和高通量分析1。微流控 芯片的最大特点是在一个芯片上可以形成多功能集 成体系和数目众多的复合体系的微全分析系统。微 型反应器是芯片实验室中常用的用于生物化学反应 的结构,如毛细管电泳、 聚合酶链反应2、 酶反应和DNA杂交反应的微型反应器等3。其中电压驱动的 毛细管电泳(Capillary Electrophoresis , CE)比较容易在微流控芯片上实现,因而成为其中发展最快的技 术4。它是在芯片上蚀刻毛细管通道,在电渗流的作用下样品液在通道中泳动,完成对样品的检测分析。 如果在芯片上构建毛细管阵列,可在数分钟内完成 对数百种样品的平行分析(其模式示意图见图1)。 自1992年微流控芯片CE首次报道以来,进展很快。 首台商品仪器是微流控芯片CE (生化分析仪,Aglient) ,可提供用于核酸及蛋白质分析的微流控芯 片产品。图1 微流控芯片技术原理示意图微流控芯片CE技术在反应体系中引入先进有 效的内对照系统,与目的基因在一个体系中同步扩增,一方面可监测PCR污染,另一方面通过LowMarker、Upper Marker定位及相对定量,可实现准确 的微量化全定量检测。同时,有高效的防污染系统, 可排除假阳性。微流控芯片仪可自动识别PCR产 物或蛋白质的不同大小的片段,并以数字化的形式直接给出有关基因的PCR产物或蛋白质的大小和 浓度等有关信息。这些图形非常直观,结果易于判 断。目前该技术已用于DNA、RNA、 蛋白质和细胞等 生物学检测。2 应用原则上,微流控芯片可以用于各个分析领域,如41现代仪器二 四年 第五期生物医学、 新药物的合成与筛选、 以及食品和商品检验、 环境监测、 刑事科学、 军事科学和航天科学等其 他重要应用领域,其中生物分析是热点。目前其应 用主要集中在核酸分离和定量、DNA测序、 基因突 变和基因差异表达分析等。另外,蛋白质的筛分在 微流控芯片中也已有报道5。针对病原微生物基因组的特征性片段、 染色体DNA的序列多态型、 基因变异的位点及特征等,设 计和选择合适的核酸探针,经PCR扩增后检测,就 能获得病原微生物种属、 亚型、 毒力、 抗药、 致病、 同 源性、 多态型、 变异和表达等信息,为疾病的诊断和治疗提供一个很好的切入点。 国际上公认的PCR产物检测共有五种方法,按 其灵敏度高低顺序排列为:毛细管电泳法、 固相杂交 法、 液相杂交法、 高压液相杂交法和凝胶电泳法(不 推荐临床)。微流控芯片CE以毛细管电泳为该芯片主体,无需进行探针杂交,受检样品的信号获得率 接近百分之百。微流控芯片CE可检测157500bp 范围的PCR产物,分辨率可达20bp ,样品微量化使 扩散进一步减少,分离效果极好,每孔可供多个不同 的PCR产物作同时分析。该技术临床应用已多有报道。(1)应用多重逆 转录PCR(multiplex Reverse Transcription - PolymeraseChain Reaction , mRT - PCR)通过多组特定引物设 计,经mRT - PCR扩增后,其产物应用微流控芯片CE检测,同时可检测数种上呼吸道病毒,并可准确鉴定病毒的种类、 型和亚型,其中可包括SARS病毒 (见图2)。图2中第1、6个峰分别为Low Marker、Upper Marker。(2)核酸扩增检测技术可缩短病毒 “窗口期”,而应用微流控芯片,可同时检测多种病原 微生物核酸的PCR产物如HBV、HCV、HIV、 梅毒等(见图3)。对献血员进行更为有效的筛选,减少甚 至避免输血传播疾病的发生。(3) HBV DNA的定量 测定能准确反映出HBV的复制水平、 病程变化和治 疗效果等,所以在乙型肝炎的临床诊断、 治疗方案选 择和抗病毒疗效观察等方面起着重要的作用。样品 中HBV - DNA经PCR扩增后,其产物应用微流控芯片CE定量检测(见图4)。图4中第1、5个峰分别 为Low Marker、Upper Marker ,第4个峰为内对照(In2ternal Control , IC) ,因而可获得高准确度和重复性的 定量实验结果。3 微流控芯片特点微型芯片的主要特点是高通量、 微型化和自动图2 SARS病毒及流感病毒检测图3 HBV - DNA定量检测图4 用血安全检测 化,是在传统生物技术和疾病诊断等方面的创新和飞 跃。 微流控芯片的发展极大地扩宽了生物芯片的内 涵,是当前微全分析系统发展的重点,它有很多优点。 微流控芯片主要以分析化学和分析生物化学为 基础,以微机电加工技术为依托,以微管道网络为结 构特征,各工作单元既能独立完成单一反应或单元 操作,也能与其他单元合作完成较复杂的工作,使整 个芯片成为一个动态的反应系统。探针和靶分子的 作用是主动式的,因而大大增强敏感性,提高反应速 率。微流控芯片把整个实验室的功能,包括样品处 理、 化学反应、 分离和检测等集成在芯片上,且可多 次使用,因此具有更广泛的适用性。每个芯片可用 于多个病人而不是一个病人一块芯片,每块芯片至 少可重复使用20次,因此比微阵列芯片更为经济耐 用。微流控芯片为通用模式的DNA芯片,特异性由PCR控制,因此可以提供检测平台。利用菜单式服 务,及时提供临床信息,也为将来长期发展新增的项 目提供基础。4 研究进展PCR反应器和CE作为复合体已被制作在一个 微流控芯片上,用作PCR - CE全分析,也可用多平51二 四年 第五期新技术应用行分离通道的微流控芯片进行高通量DNA分析。这种集成装置可使分析一个样品的全部时间缩短到20min ,包括芯片上的PCR扩增和CE分离,大大加 快PCR的分析速度,不需人工转移PCR产物,而且 可实时控制PCR的扩增。其中引人注目的是An2derson等6和Gattschlich等7的研究报道。前者的芯片集成细胞裂解、RNA提取纯化、 逆转录PCR、 套式PCR、DNA酶消化、DNA片段脱磷酸化、 末端转移酶 催化标记、 靶DNA与探针点阵杂交和信号检测等多 种功能,可进行自动化的HIV基因分型。后者是一 个集成的蛋白质分析芯片,可在芯片上连续进行酶促反应、 反应产物电泳分离、 分离后各组分的标记和 信号检测等过程。中国科学院大连化学物理研究所 采用自行设计的RT- PCR试剂盒,实现了PCR和电 泳检测的微流控芯片在线分析8。微流控芯片的集 成微分析系统正在继续发展中。芯片实验室技术仍处于早期研究阶段,但是由 于其显著的优点和潜在的巨大商业价值,它从出现 至今一直在快速地发展,特别是集成毛细管电泳、 荧 光标记和PCR技术于一身的微流控芯片,以其在基 因测序、 基因表达、 疾病诊断及药物筛选等诸多领域的应用前景引起人们的极大关注。参考文献1 齐小花,张新祥,常文保.微流控芯片仪器进展,现代仪器,2002 ,4:12152 Jeff Chiou , Paul Matsudaira , Ain Sonin ,et al. A closed - cyclecapillary polymerase chain reaction machine. Anal Chem ,2001 ,73:201820213 杨军,李卓荣,杨梦更.芯片实验室(微流芯片)技术,生物化学与生物物理学报,2002 ,34:1171234 Bublmann C,Preckel T,Cban S,et al. A new tool for routinetesting of cellular protein expression: integration of cell stainingand expression on a micro - fluidic chip - based system.Biomolecular Techniques , 2003 ,14:1191275 高志贤.蛋白芯片技术研究进展及其应用,现代仪器,2004 ,3:156 Anderson RC,Su X,Bogdan G J ,et al. A miniature integrateddevice for automated nultisep genetic assay. Nucl. Acids Res ,2000 ,28:e607 G ottschlich N , Gulbertson CT,Mcknight TE,et al. Integratedmicrochip for digestion , separation and postcolumn labeling ofproteins and peptides. J. Chromatog B ,2000 ,745:2432498 周小棉,梅晓丹,刘大渔等. SARS病毒的微流控芯片实验室系统检测,现代科学仪器,2003 ,4:1316(感谢上海黄道培教授提供应用实例图片)Microfluidic chip technique and its application on laboratory medicineYue Zhihong Zhang Zheng(Peoples Hospital of Peking University , Beijing 100044) Abstract Lab2on2a2chip has been widely used in bioscience research as a new technical flat. Microfluidic2based mi2crodevices can be applied in both the fields of genomics and proteomics ,including analysis of gene express , gene poly2morphism studies and clinical diag