D D D DATA ATA ATA ATA S S S SHEETHEETHEETHEET www.tbdscience.com 本品适用于科学研究，不能用于临床 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD 236# Baidi Road Nankai District Tianjin 300192 P.R China 技术服务 Tel: 15822121119 15822691119 Fax: 86-22-87893403 87894017 QQ:387745440 2572212016 www.tbdscience.comE-mail:gx15822121119eyou.com 灏洋生物 TBDsciences ProductInformation 各种动物各种动物各种动物各种动物外周血和外周血和外周血和外周血和脏器组织脏器组织脏器组织脏器组织胰岛胰岛胰岛胰岛细胞分离试剂细胞分离试剂细胞分离试剂细胞分离试剂盒盒盒盒操作说明操作说明操作说明操作说明： Store at: RT C Size :4X50ml 试剂盒内容 试剂：全血及组织匀浆稀释液 100ml 试剂：细胞洗涤液 100ml 试剂A： 50ml 试剂B： 50ml 试剂C： 50ml 试剂D： 50ml 说明书 1份 操作方法（操作全过程应在20-25度环境下进行） 1， 在10ml或15ml玻璃离心管中依次小心加入A、B、C、D 4种液体各 2ml,制成梯度界面（各液面分层一定清晰）。 2, 取 1ml肝素抗凝血与全血及组织匀浆稀释液（或胎牛血清或人血清 悬起匀浆的细胞 1X107/ml）1：1混合后于D液上重叠，以 1000-1500rpm /min离心30min，在D液中和C液的界面上富含胰岛细胞。（纯度约为80%）。 3， 吸出富含胰岛细胞层以细胞洗涤液洗涤三次备用。 细胞放入含细胞洗涤液 （Cat#： 2010X1118） 4-5毫升的试管中， 充分混匀后， 以1500-2000 转/分离心10-30分钟。沉淀经反复洗2次即得所需细胞。 D D D DATA ATA ATA ATA S S S SHEETHEETHEETHEET www.tbdscience.com 本品适用于科学研究，不能用于临床 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD 236# Baidi Road Nankai District Tianjin 300192 P.R China 技术服务 Tel: 15822121119 15822691119 Fax: 86-22-87893403 87894017 QQ:387745440 2572212016 www.tbdscience.comE-mail:gx15822121119eyou.com 灏洋生物 TBDsciences 分离图例分离图例分离图例分离图例： 注注注注 意意意意 TBD 实验室的细胞分离培养基是敏光型的。这种培养基在运输和贮藏过程中应避光保温。由于 各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以 调节离心转数，调节离心的时间，摸索最佳的分离条件（具体分离条件各实验室自定） 。组织， 血液，细胞要求新鲜，避免冷冻和冷藏。 贮贮贮贮 藏藏藏藏 18-25避光保存。启封后置 4保存。本品为真空包装，未启封前置于 10 以下易出现白色结 晶，影响分离效果。 相关试剂相关试剂相关试剂相关试剂 货号 名称 规格 TBD2012SCP 细胞冻存液 100ml TBD2012UCP 脐带保存液 100ml TBD2012CP 淋巴细胞保存液 100ml 2010C1119 全血及组织匀浆稀释液 200ml 1500-2000rpm离 心 15-30 分钟 2,加入分离样品组织 血浆或组织匀浆液层 富含胰岛细胞分离液层 胰岛细胞层 单个核细胞层 分离液层 红细胞层 1,依次加入 A， B，C，D 细胞分离液 1000-1500rp m /min 离心 40min 分离液层 D D D DATA ATA ATA ATA S S S SHEETHEETHEETHEET www.tbdscience.com 本品适用于科学研究，不能用于临床 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD 236# Baidi Road Nankai District Tianjin 300192 P.R China 技术服务 Tel: 15822121119 15822691119 Fax: 86-22-87893403 87894017 QQ:387745440 2572212016 www.tbdscience.comE-mail:gx15822121119eyou.com 灏洋生物 TBDsciences 2010X1118 细胞洗涤液 200ml TBD2012HSCI 造血干细胞流式检测系统 50T TBD2012MSCI 间充质干细胞流式检测系统 50T 各种细胞因子 细胞培养耗材 详情请查询灏洋生物网站（www.tbdscience.com）vip 库存系统。 组织单细胞悬液的制备组织单细胞悬液的制备组织单细胞悬液的制备组织单细胞悬液的制备（全过程及所需试剂要求无菌环境） 剪碎法剪碎法剪碎法剪碎法：将组织块放入平皿后，加入少量 PBS+10%胎牛血清；用眼科剪将组织剪至匀浆 状，加入 10 ml PBS+10%胎牛血清；用吸管吸取组织匀浆，用 100 目不锈钢滤网过滤到试管 内；离心沉淀 1500 rpm3 min，再用 PBS+10%胎牛血清洗 3 次，每次以 500 rpm 短时低速 离心除去细胞碎片，以 200 目不锈钢滤网过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为 （25）107 /ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用胎牛血清悬起细胞浓度为 1107 /ml 的单细胞悬液备用。 匀浆器法匀浆器法匀浆器法匀浆器法：用眼科剪将组织剪成小块；放入 70 ml 组织研磨器内，加入 2 ml PBS+10%胎 牛血清； 缓慢转动研棒， 研磨至匀浆； 用 10 ml PBS+10%胎牛血清冲洗研器； 收集细胞悬液， 经 200 目不锈钢滤网过滤；离心沉淀 800 prm2 min ，再用 PBS 洗 3 次，离心沉淀。以下 处理同剪碎法。 细胞计数细胞计数细胞计数细胞计数方方方方法法法法 细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板（血球计数板） 进行。即可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于 对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。 计数与计算过程 1） 、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。 D D D DATA ATA ATA ATA S S S SHEETHEETHEETHEET www.tbdscience.com 本品适用于科学研究，不能用于临床 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD 236# Baidi Road Nankai District Tianjin 300192 P.R China 技术服务 Tel: 15822121119 15822691119 Fax: 86-22-87893403 87894017 QQ:387745440 2572212016 www.tbdscience.comE-mail:gx15822121119eyou.com 灏洋生物 TBDsciences 2） 、用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻 片被液体充满为止。 3） 、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对 于细胞团按单个细胞计数。 4） 、按下式计数细胞悬液的密度： 细胞密度（4 个大格细胞总数/4）104个/ml 稀释倍数 公式中乘以 104因为计数板中每一个大格的体积为： 1.0mm（长）1.0mm（宽）0.1mm（高）0.1mm3 而 1ml1000mm3 细胞计数要点： 1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于 104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再 悬浮于少量培养液中；显微镜下计数时，遇到 2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细 胞计算。如果细胞团10，说明细胞分散不充分; 或细胞数500 个/10 mm2 时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。 2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀， 以求计数准确； 4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞 压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。 5. 操作时，注意盖玻片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 初学者易犯的错误： 1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。 2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。 3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。