http:/www.paper.edu.cn -1- 单色光对鸡视网膜节细胞层细胞的影响单色光对鸡视网膜节细胞层细胞的影响1 曹静， 王子旭，陈耀星 中国农业大学动物医学院，北京（100094） E-mail：caojing315126.com 摘摘 要要：本试验采用 LED（Light-emitting diodes）灯作为光源，将 60 只刚出壳的雄性 AA 肉鸡分别在白（400nm760nm） 、红（660nm） 、绿（560nm）和蓝光（480nm）下饲养，光 照强度 15 lux，光照制度 23h:1h（L:D） 。在 49 日龄时取两侧视网膜分别做 Nissl 染色和 DiI 标记，利用 Scion Image 软件测量视网膜面积、节细胞层细胞的大小和密度。结果显示，蓝 绿光可促进视网膜的发育， 在颞侧周边区 RGCs 随波长的减小细胞逐渐增大、 密度逐渐降低， 说明颞侧周边区的 RGCs 的细胞大小和密度与光色有关。同时，红、绿、蓝光能促进 dACs 的生长，但不同区域其促生长作用不同。 关键词关键词：单色光；鸡；视网膜节细胞层；细胞大小；细胞密度 由于禽类视觉和处理光信息的特殊性，其生产性能对光环境变化特别敏感。光信息是影响鸡生产力表现的重要因素之一。有报道显示，影响家禽生产力表现的诸因素中，遗传力只占 5%50%，而 50%95%则取决于环境条件杨宁等，1994。因此，现代养禽业普遍采用人工光照来提高生产性能。我们前期的研究结果发现在肉鸡生长后期（2749 日龄）蓝光能促进肉鸡的生长，说明蓝光在肉鸡出栏时能提高其生产性能。 众所周知，禽类处理光信息的结构基础包括视网膜、视神经通路和视觉中枢，其中视网膜是处理光信息的第一环节。 它是由细胞层和纤维层构成的分层结构， 其中位于视网膜内侧的节细胞层是由视网膜节细胞（Retinal ganglion cells，RGCs）的细胞体和无长突细胞（Amacrine cells，ACs）构成。ACs 是一类特殊的无长突细胞，它是由视网膜内颗粒层移位于节细胞层，也称为移位性无长突细胞（Displaced amacrine cells，dAC） ，这类细胞对节细胞层的 RGCs 起局部调节作用Hayes，1984；Koontz et al.,1993；RGCs 是视网膜的唯一传出神经元，其树突伸向内网状层，轴突构成视神经纤维层，各种光信息都是通过 RGCs传至视觉中枢进而影响禽类的生产活动。但有关单色光对于节细胞层细胞的研究较少，因此，本实验利用 Nissl 染色和荧光染料 DiI 标记技术探讨单色光对视网膜节细胞层细胞的影响，对于阐明禽类特有的视觉机能、丰富视觉理论、以及促进养禽业的发展具有重要的指导意义。 1材料和方法材料和方法 1.1 试验动物试验动物 60 只刚出壳的雄性 AA 肉鸡购自北京爱拔益加家禽育种有限公司，被分为 4 个处理组，每组 15 只。分别在白（400nm760nm） 、红（660nm） 、绿（540nm）和蓝色（480nm）LED灯（发光二极管，中山市晶明光电科技有限公司制造）下饲养。光照强度为鸡头水平方向15 lux， 使用 ST-85 自动照度仪 （北京师范大学光电仪器厂制造） 测量。 光照制度 23h:1h （L:D） 。自由采食和饮水，饲养过程严格遵循AA 肉鸡饲养管理手册 。 1.2 动物处理动物处理 1本课题得到北京市自然科学基金资助项目 （6032014） ， 高等学校博士科学点专项科研基金 （No.2004019002）和新世纪优秀人才支持计划（No.NCET-04-0126）的资助。 http:/www.paper.edu.cn -2- 动物饲养 7 周，腹腔麻醉（戊巴比妥钠，45g/g） ，小心剥取双侧眼球，一侧置入 10%甲醛溶液后固定 24h，另一侧置入 4%多聚甲醛磷酸缓冲液中备用。 1.3 Nissl 染色染色 10%甲醛固定的眼球做视网膜铺片Chen and Naito，1999；2000。完整剥离视网膜，然后在涂有明胶的载玻片上将视网膜展平，其上盖一层光滑硬纸和两层滤纸，再加一载玻片，用细线捆住。之后将上述铺片浸入 4中性甲醛纯乙醇（1:9）溶液中固定 24h，再将视网膜铺片浸入 5%醋酸-纯乙醇溶液中约 12h 后，按常规 Nissl 染色法，用 0.1%克紫溶液染色20min，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。 1.4 DiI 法法 4多聚甲醛磷酸缓冲液固定的眼球用来做荧光标记Naito and Chen，2004a，2004b。用细小镊子将 DiI 晶体颗粒埋植在视神经断端。然后将连有眼球壁的视网膜浸入 4多聚甲醛磷酸缓冲液（0.1M，pH 7.4）中，37温箱孵育 3 个月。然后将视网膜完整的剥离出来，放入 4%多聚甲醛磷酸缓冲液内，后固定 12h（4） 。最后在载玻片将视网膜展平，滴加荧光封片剂，荧光显微镜下观察。 1.5 数据分析数据分析 根据Naito and Chen（2004a）对鸡视网膜的区域划分，对经Nissl 染色的视网膜铺片标本的视网膜节细胞层的中央区（Central area，CA） 、鼻侧周边区（Nasal periphery，NP）和颞侧周边区（Temporal periphery，TP）用20倍物镜(总放大倍数为200倍)进行显微照相，再将每张底片放大5倍图像描于复印纸上(画出细胞体的外轮廓线)。用Scion Image 软件（Version Beta 4.0.2，美国Scion公司）统计视网膜节细胞层的细胞密度和胞体面积。对经DiI 荧光标记的视网膜铺片置荧光显微镜（Olympus，BX51）下观察，并对标记良好的视网膜节细胞的胞体进行照相，用数码相机输出。同样用Scion Image 软件计算视网膜节细胞的胞体大小。最后对Nissl 染色和DiI 标记的有关数据用SPASS 11.0 软件的单因素方差分析（ANOVA）LSD法进行生物学统计，P0.05） 。 2.2 单色光对视网膜节细胞层不同区域节细胞胞体大小的影响单色光对视网膜节细胞层不同区域节细胞胞体大小的影响 如表 1 所示， 比较不同光色下视网膜节细胞层不同区域节细胞胞体大小。 从所测得的数据来看，由视网膜的中央到外周，RGCs 的胞体是不断增大的；不同光色下中央区 RGCs 胞体最小，鼻侧周边区 RGCs 胞体最大。在 NP，蓝光组 RGCs 胞体面积最大，分别比白、红和绿光组大 12.29%、8.74%和 1.69%；在 CA，蓝光组的 RGCs 胞体面积最小，比白、绿光组分别小 7.68%和 5.74%（P0.05） ；在 TP，蓝光组RGCs 胞体面积最大，分别比白、绿和红光组大 14.00%、20.85%和 27.52%（P0.05） 。 表 1 各试验组视网膜节细胞层不同区域节细胞胞体大小的比较（m2） Table 1 Comparison of the somal area of retinal ganglion cells in various groups at different zone 白光 红光 绿光 蓝光 NP 103.1851.28b 106.5543.83ab113.9452.61a115.8659.64a CA 70.1419.91a 66.0915.00b 68.8815.42a65.1415.09b TP 100.3260.67b 89.6851.20c 94.6349.65bc114.3665.94a 注：同一行标注不同字母表示差异显著，标注相同字母表示差异不显著，下表同。 2.3 单色光对视网膜节细胞层不同区域节细胞密度的影响单色光对视网膜节细胞层不同区域节细胞密度的影响 单色光对视网膜节细胞层不同区域节细胞密度的影响如图 2 所示。 各光组在 CA 节细胞密度最高，而在 NP 和 TP 节细胞密度都降低。在 NP 白光组 RGCs 密度最高，比红、绿和蓝光组分别高 6.94%、 12.43%和 9.76% （P0.05） ；在 CA，绿光组 RGCs 密度最高，比蓝光组高 28.91%（P0.05） ； 在 TP， 蓝白光组 RGCs 密度最低， 比红、 绿光组分别低 36.76%和 18.91% （P0.05） 。 0100200300400500600700WRGBRetinal area (mm2)aab bcchttp:/www.paper.edu.cn -4- 图 2 各试验组视网膜节细胞层不同区域节细胞密度的比较 Fig.2 Comparison of the density of retinal ganglion cells in various groups at different zone 2.4 单色光对视网膜节细胞层不同区域移位性无长突细胞胞体大小的影响单色光对视网膜节细胞层不同区域移位性无长突细胞胞体大小的影响 单色光对视网膜节细胞层不同区域的移位性无长突细胞胞体大小的影响见表 2。无论是在视网膜的中央还是外周， dDACs 的胞体大小均一， 但在不同光色下相同区域的 dACs 胞体大小有差异。从表中可看出，白光组在 NP、CA 和 TP，其 dACs 胞体面积都是组间最小的。在 NP，白光组 dACs 胞体面积比其他光组小 32.00%（P0.05） 。 表 2 各试验组视网膜节细胞层不同区域移位性无长突细胞胞体大小的比较（m2） Table 2 Comparison of the somal area of displaced amacrine cells in various groups at different zone 白光 红光 绿光 蓝光 NP 28.758.31d 34.559.17c41.429.69a37.889.44b CA 33.5110.35c 37.747.27a35.758.75b35.069.94b TP 33.6811.07c 36.9211.79b40.3711.67a41.6813.62a 2.5 单色光对视网膜节细胞层不同区域移位性无长突细胞密度的影响单色光对视网膜节细胞层不同区域移位性无长突细胞密度的影响 单色光对视网膜节细胞层不同区域移位性无长突细胞密度的影响如图 3 所示。 与节细胞密度变化趋势相同，各光组在 CA 的移位性无长突细胞密度最高，而在 NP 和 TP 密度都降低。在 NP 白光组 dACs 密度最低，平均比红、绿和蓝光组低 127.33%（P0.05） ；在 CA，蓝光组 dACs 密度最高，比白光组高 18.21%（P0.05） ；在 TP，蓝白光组 dACs 密度最低，比其他三组低 50.77%（P0.05） 。 02000400060008000100001200014000NPCATPThe density of RGCs (cells/mm2)W R G Baababbaababbabcchttp:/www.paper.edu.cn -5- 图 3 各试验组视网膜节细胞层不同区域移位性无长突细胞密度的比较 Fig.3 Comparison of the density of displaced amacrine cells in various groups at different zone 3讨论讨论 视网膜又称为“外周脑”，可对视觉信息进行初步加工，其节细胞层内的唯一传出神经元RGCs可将视觉信息传递到视觉中枢（丘脑、下丘脑和视顶盖） ，进而影响垂体-性腺轴释放激素来调节机体的生长发育Yahav et al.，2000；Halevy et al.,1998、生产性能Rozenboim etal., 2004; Felts et al.,1990、生殖功能Rani et al.,