肝细胞死亡的基础与临床研究同济医院感染性疾病研究所同济医院感染科宁琴 教授内容肝细胞死亡的模式肝细胞死亡与肝脏疾病 肝细胞死亡的调控 结论结论1234凋亡 启动原因死亡受体/配体 DNA损伤 生长因子缺乏 主动过程 程序性细胞死亡 坏死 继发于重型病毒性肝炎 缺血/再灌注损伤 急性药物性肝炎 被动过程 显著的炎症反应 肝细胞死亡的模式 肝细胞死亡细胞坏死与凋亡的形态区别旧观点n凋亡与坏死被认为是两种截然不同的现象新观点n凋亡与坏死是源于相同启动因素和信号转导途 径的不同的细胞死亡方式，而线粒体功能损伤 在这一过程中起到关键的连接作用。 线粒体是细胞生命活动的控制中心 氧化磷酸化中心 细胞凋亡调控中心 细胞呼吸链中心线粒体凋亡存在两条不同的信号传导途径一类细胞中含有足够的Caspase8可被经典的死亡受 体活化，直接激活效应Caspase；另一类细胞其死亡受体介导的Caspase8活化不能达 到很高的水平，凋亡信号需要借助线粒体途径来放 大，而细胞色素C的释放是这一途径的关键步骤。 线粒体在凋亡中的作用 缺血再灌注，肝细胞毒素（N-乙酰 苯醌亚胺 NAPQI ，胆酸，死亡受体 活化等） 集中作用于线粒体，导致 其膜透化。 Bcl2家族成员包括caspase 8 活化 形成的tBid,导致外膜透化。其透化 可能包括外膜通道的形成或是线粒 体肿胀破裂后诱导MPT。 其他应激因素可直接导致MPT.膜 透化后，细胞色素C释放相继激活 caspase 9 和caspase 3，从而诱导 细胞凋亡 。而由于线粒体功能的严 重异常，ATP减少，caspase 活化 被阻断则会发生坏死。坏死和凋亡是线粒体透化的不同结果肝细胞死亡与肝脏疾病死亡受体/配体诱导的肝细胞损伤1穿孔素/颗粒酶诱导的肝细胞损伤2缺血/缺氧诱导的肝细胞损伤3胆酸诱导的肝细胞损伤4药物诱导的肝细胞损伤51.死亡受体/配体诱导的肝细胞损伤目前认为在肝脏中发挥重要作用的死亡受体主要包括Fas、TNFR1及TRAIL-R1/R2，后者与它们相应的配体FasL、TNF和TRAIL结合后可诱导受体发生寡聚化并活化其胞内的死亡结构域，与相应的连接蛋白相互作用进而触发凋亡的级联反应。1.死亡受体/配体诱导的肝细胞损伤1.1.Fas/FasL诱导的肝细胞损 伤2.2.TRAILR/TRAIL诱导的肝 细胞损伤3.3.TNFR1/TNF诱导的肝细 胞损伤1）Fas/FasL诱导的肝细胞损伤Fas在肝实质细胞、血窦内皮细胞、星状细胞及枯否 氏细胞上具有广泛的表达。自然杀伤细（NK）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）可 通过分泌FasL启动凋亡程序来清除病毒感染 的肝细 胞或肿瘤细胞。NK细胞杀伤自身肝细胞的机制Hepatology. 2004 J Exp Med. 2007 Hepatology. 2007CTL细胞对肝细胞的杀伤作用1）Fas/FasL诱导的肝细胞损伤研究发现 乙型、丙型病毒性肝炎患者体内可溶性Fas的表达有所增加，且表达 水平与疾病活动度及治疗应答反应相关。 当HCV特异性的FasL表达的CTL被动移植至稳定表达HCV结构蛋白 的小鼠体内后，小鼠肝细胞出现损伤，血清谷丙转氨酶（ALT）水平 升高。在HBV转基因小鼠中，HBV特异性CTL也能导致急性肝损伤甚至肝衰 竭 酒精性肝炎患者的血清中可以发现其可溶性Fas的表达也是上调的 酒精和HCV病毒可在Fas信号转导途径诱导的肝脏损伤中发挥协同作 用 非酒精性脂肪肝患者中，其Fas的表达和肝细胞凋亡的发生也是增加 的。 Fas诱导的凋亡在暴发性肝衰竭的发生发展中也占有一席之地 2）TRAILR/TRAIL诱导的肝细胞损伤研究发现病毒性肝炎患者中其血清TRAIL的表达水平显著增高 ；小鼠肝细胞在病毒感染后也能诱导上调TRAIL的表达 ，通过TRAILR/TRAIL途径诱导感染肝细胞的凋亡。Fas 和 TRAIL 受体信号Fas 和TRAIL 的死亡诱导信号复 合物 (DISC) 类似. TRAILR1/TRAIL-R2或Fas 与其 配体 TRAIL或FasL结合后，通 过与死亡结构域(DD)的同型反应 招募调节蛋白FADD。FADD 包含死亡效应结构域 (DED)，可招募并分裂 procaspase 8 和10, 使其活化。Caspase 8 将Bid分裂为tBid， 致使线粒体透化，功能失常和凋 亡。3）TNFR1/TNF诱导的肝细胞损伤正常肝细胞中TNFR1的表达水平很低，但各种急慢性肝脏疾病中，TNFR1会在肝实质细胞、血窦内皮细胞和炎性浸润细胞中大量表达。除了诱导凋亡途径，TNF还能通过NFB依赖的基因表达途径促进肝细胞的增殖，在部分肝切除后肝细胞的再生中起重要作用。 TNFR表达过量时会导致肝细胞损伤加剧而肝脏再生失败。 3）TNFR1/TNF诱导的肝细胞损伤在肝脏移植中，供体与受体的TNFR1发挥相反的效应，表现为供体TNFR1的缺陷可加剧移植物的损伤，而受体TNFR1缺陷时肝损伤有所缓和且炎性细胞浸润减少。在酒精性肝炎患者中，其血清TNF和TNFR1的水平均上升并与死亡率相关。病毒性肝炎患者中，其TNF的水平与治疗应答反应呈负相关。 TNFa受体介导的信号TNF与TNFR结合后，与TRADD, RIP, TRAF-2共同形成Complex I，激活 NFkB 和JNK. NFkB 激活某些survival gene(包括抗凋亡蛋白c-FLIP, IAPs, Bcl-XL和 A1)的转录。 Complex I 经过修饰和内化形成Complex II (DISC) ,后通过与DD 的相互作用及激活procaspase 8来招募FADD（Fas相关死亡结构域）。活化的 caspase 8 将Bid （促凋亡蛋白）分裂为 tBid, 转移至线粒体后导致其透化，功 能障碍及凋亡。2.穿孔素/颗粒酶诱导的肝细胞损伤穿孔素(perforin)主要存在于CTL和NK细胞 的 胞浆中,是CTL和NK细胞发挥细胞毒效应的另一 重 要途径。 2.穿孔素/颗粒酶诱导的肝细胞损伤穿孔素可在靶细胞膜上形 成跨膜孔道1）引起细胞渗透性改 变、钙离子内流和能量的耗竭，导致靶细胞融解和细胞死亡。2）穿孔素形成的跨膜通道可以使颗粒酶 （granzyme）进入靶细胞，颗粒酶进一步 通过蛋白水解激活Caspase家族的某些成员触发Caspase级 联反应，导致靶细胞 凋亡。2.穿孔素/颗粒酶诱导的肝细胞损伤研究发现，穿孔素在慢性乙肝肝细胞损伤中 发 挥了重要的作用，也是慢性丙肝患者肝细胞损 伤的主要效应分子。 3.缺血/缺氧诱导的肝细胞损伤1.缺血-再灌注损伤2.免疫凝血途径诱导的肝细胞坏死1）缺血-再灌注损伤发生于肝脏的缺血-再灌注损伤可分为两个阶段:第一阶段 反映了直接的肝细胞损伤。 第二阶段 涉及到天然免疫系统的激活，特别是缺血后 肝 脏枯否氏细胞的活化，以及中性粒细胞、淋 巴 细胞的炎性浸润。缺血-再灌注损伤在肝细胞的体外热缺血-再灌注损伤模型中 ，肝细胞急剧肿胀坏死。 体内肝脏发生缺血-再灌注损伤后，其急性阶 段也主要表现为肝细胞的坏死。 缺血-再灌注损伤其他观点缺血-再灌注损伤后，肝细胞的凋亡和坏死是 并存的，损伤的强度和持续时间决定了细胞 的死亡方式，即严重的损伤会导致早期发生 的肝细胞坏死，而轻度的损伤则发生延迟的 凋亡反应。 Serine 89fgl2凝血酶原酶属于纤维蛋白原超 家族，由活化巨噬 细胞或内皮细胞产 生，可直接催化凝 血酶原转变为有活 性的凝血酶，从而 快速启动凝血过程 ，促使纤维蛋白原 转化为纤维蛋白， 促进血栓形成。Domain1 N-terminal Linear ProcoagulantDomain 2 C-terminal Globular FRED免疫凝血途径诱导的肝细胞坏死 免疫凝血途径诱导的肝细胞坏死系列研究发现，活化巨噬细胞（内皮细胞）/fgl2凝血酶原酶介导的免疫凝血途径可通过促进肝脏纤维素沉积和微血栓形成引发肝脏的微循环障碍，最终肝细胞 缺血缺氧，ATP合成障碍而触发肝细胞坏死的发生。 J Virol, 1997, J Immunol 1998, J Clin Invest 2003, 中华医学杂志W J G 2006, Human Gene Therapy 2006，中化肝脏病杂志 ， J Biol Chem. 1999, and J Biol Chem 2003 Kupffer Cells/ MacrophagesFulminantviralhepatitisapoptosisnecrosisCoagulatoin activation Fgl2 prothrombinaseIFNH CFasLCaspase cascadeInflammation cytokinesFas CTLVirusVAgTCR肝内枯否氏细胞、内皮细胞fgl2高表达， 是暴发性肝炎肝细胞坏死的重要机制胆酸诱导的肝细胞损伤体外细胞培养体系中，毒性胆盐可以通过Fas或TRAIL依赖的途径引起肝细胞凋亡。 在急性胆汁淤积的发生中，Fas及其他信号途径也能导致严重的线粒体功能障碍及ATP的耗竭，促进细胞坏死的发生。 药物诱导的肝细胞损伤在美国对乙酰氨基酚的过量使用是造成急性药物性 肝损伤的主要原因 肝细胞凋亡与坏死共存于对乙酰氨基酚诱导的肝损 伤：1）当药物造成了ATP的完全耗竭，肝细胞坏死发 生；2）当D-果糖与甘氨酸的运用减缓了ATP的耗竭，则Caspase诱导的凋亡途径占优势。 肝细胞死亡的调控1. 正常肝细胞死亡的干预2. 异常肝细胞死亡的诱导正常肝细胞死亡的干预 Caspase抑制剂 抗氧化剂 凋亡坏死关键基因的RNA干扰 细胞因子 中草药 血浆置换 异常肝细胞死亡的诱导选择性的增加肿瘤细胞对于TRAIL介导的凋亡途径的敏感性，有助于清除肝脏肿瘤细胞，保护正常的肝细胞。 通过药物和基因干预手段靶向诱导某些非肝实质细胞（星状细胞）进行凋亡，可能会抑制或扭转肝纤维化的发生发展。结论 肝脏疾病中的多种因素均能导致肝细胞通过凋亡或坏死 途径发生死亡。肝细胞的凋亡与坏死并非完全独立的两条通路，而是代表了 细胞死亡同一胞内途径尤其是线粒体途径的两种不同结果。 关于肝细胞坏死与凋亡的基础和临床研究将加深我们对于各种肝脏疾病发病机制的了解，对于肝脏疾病的预防和治疗将起到重要作用。