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!“ 卷# 期 $%“ 年 70.10:?ABC0DBC,E作者简介: 廖丹 (7 的高纯度蛋白。要得到满足数量和纯度要求的蛋白, 一般来说可以从以下四个方面来考虑: 从天然蛋白中纯化; 化学合成; 体外表达系统表达分离; 通过异源表达纯化得到。通常情况下, 天然条件下膜蛋白的含量过低, 分离纯化困难。而化学合成受肽链长度的限制, 迄今未有成功合成膜蛋白的报道。体外表达系统是很有潜力的!, 但它的成本高, 而且缺乏必要的翻译后修饰, 目前仍然没有大规模应用。异源表达仍是大多数人的首选途径。研究者对此作了大量的探索工作。结核病目前依然是严重威胁人类健康的传染病之一, 结核分枝杆菌 (!“#$% 和 JJ; 家族、 ST 元件、 分子伴侣、 细胞色素等(U-V: WWAAAC9E01C9,CBL) 。$%$ 年美国 X9-=.E96 P=U N9E0-=, 8=06D Y9/.19-.1Z 开展了N53 膜 蛋 白 结 构 基 因 组 计 划 (N0E0-C BC 0DBW ) :? : -(-/96?( .9:#(?$ 9:- !“#$%#8( #H: .9:#(?$I#“7E:$F( 6?F #(#96E7?( 9($#6?(!I00B5N!J!“#$% #: 00B 6-7E“:?$ : 9;O #: P6Q H(9( (=.9($(F ? !“#$% 6 $?;7(G 86?(7 :?F:? : #8( ;(?( H6$ #:= #: #8( 8:$#,/-#(F 6-:(F 9:- (77$ /(:9( ;9:H#8 (6$(FI( :?F?(F /E =G 96E9E$#677:;96.8E#:5416?;$#9:-$ 9($:7:?TO2$.!345!I/.#0()*#0* H(9( (=.9($(F $;?67 9(:;?#:? .69#7() 以及分子伴侣 (?(#T$?YYS!N。它已经用于原核和真核膜蛋白的异源表达。有意思的是, 在乳酸乳球菌中没有发现包涵体的存在!N。另外, 一种古菌, 嗜盐杆菌 (3 蛋55M廖丹等:结核分枝杆菌膜蛋白的异源表达与纯化研究进展TY微生物学报 (OJJN) IN (1)白的产量!“。推测其他好几种膜蛋白在这种嗜盐杆菌中也有相似的表达量!“, 因此它们作为表达膜蛋白的宿主是很有潜力的。很多真核膜蛋白用原核表达系统效果欠佳。真核表达系统成为一种重要选择。鉴于 #$% 膜蛋白中有类似真核的分子, 以及 #$% 真核细胞胞内寄生的特性, 用真核表达系统也不失为一种选择。单细胞真核生物酵母是一种重要的表达宿主, 在表达 #$% 的抗原 495 951,62?8,03./+#$,*“#$“% -).“的改变、溶氧的变化、 培养基的消耗等。诸多代谢途径产生抑制物的堆积也是限制性因素的一类。在一个连续的培养过程中, 能源物质的浓度可以依据过程中消耗的量来进行补充, 调节其它因素也能获得更多的产物。此法适用于大规模发酵生产。!“$通过包涵体复性的方法获得膜蛋白当膜蛋白没有可溶性表达或表达量太少不能达后续纯化步骤的要求时, 可以考虑采用包涵体复性的方法。分子量小的膜蛋白复性成功率要高些。分子量从 ! 万到 “ 万之间的膜蛋白有成功的例子), )。#$% 膜蛋白 APQU 即是通过包涵体复性的方法得到足够的样品进行核磁共振 (2B=./,10,C2/56= 1/942,2=/)分 析 的。 ( :553: 0,C2/5K J9BK /B 03145/62#%(_/-)通过包涵体复性得到膜蛋白的步骤主要有分离包涵体;通过尿素、 盐酸胍等变性剂溶解蛋白, 如有需要加入强去垢剂促溶; 加入磷脂, 去垢剂混合物; 去除变性剂使蛋白复性。有意思的是, 有研究表明通过包涵体复性得到的蛋白比通过细胞膜上分离纯化得到的蛋白产生的晶体得到的分辨率更高)O。但必须知道, 摸索包涵体复性条件操作繁琐, 并且复性成功的膜蛋白数量有限。目前对于包涵体形成以及蛋白质复性的分子机理尚未完全明了, 所有成功的复性都是建立在大量选择优化实验的基础上。没有固定的方案可以适用所有的蛋白。目前基于蛋白拓扑学、 动力学以及工程学的研究为膜蛋白的体外折叠提供理论数据, 生物信息学为蛋白质体外复性构建模型以及提供最佳复性条件。当细胞膜环境能够很好模拟, 折叠过程的分子动力学过程能得到控制, 通过包涵体复性获得膜蛋白将是一条重要的途径。$膜蛋白的纯化$“#胞内功能性表达膜蛋白的纯化膜蛋白的纯化包括分离细胞膜; 选择合适的去垢剂解构膜的脂双层分子结构, 释放膜蛋白; 亲和, 凝胶或离子交换层析纯化蛋白这几个主要步骤。但也有直接用去垢剂溶解细胞, 再用亲和层析的方法得到目的蛋白的。例如已经完成了晶体结构测定的 #$% 机械感受通道蛋白 #9=E, 它的纯化步骤就是先将 ! *TC 诱导的重组细胞溶解在含有 !VD的AA# (4/=G.F“FAF0,.5496/) 中, 使蛋白溶解, 再在含有 DV!的 AA# 溶液中, 通过 H6 亲和层析, 离子交换以及凝胶层析)+ESPX A,2 ,( %.K4#(% 9“#*)6“).):“#% ;“0“#% (*DDY) Y (O)纯化得到足够纯度的蛋白质。得到的晶体结构分辨率能达到 !“#$%!。!“#包涵体复性得到膜蛋白的纯化有些蛋白在较高的尿素浓度下, 仍能结合在离子交换柱上, 故能在变性的情况下纯化。但大多数蛋白是在完成变性的过程后, 再进行纯化。通过凝胶过滤可以使折叠错误的蛋白与正常蛋白分开, 因为它们之间构象的差异导致了分子流动动力学半径的不同!*672,*021?6?*026 ;*+672 +;+A+,B C7- 0 -77+2 + =+?;A66 ,62+?61: % +C6*PMA 0;*+0=- + 0=611 1*M=M*6,PM2=7+2 026721: *+(, -!“,FGG%“ %$*+,*611+P?6?*026;*+6721*M=M*66*?7207+2: ./“!)0 ,1),FGG,!:%RI H %RR“ J=-C0*S L,/ -* K,J=-2676=-27VM6 P+* -6 A0*,6 1=0A6 ;*+7+2 +P 726,*0A?6?*026 ;*+672: *+(, %2/0#$,FGG0*0A Y,T-0E*00*B .D: D0?0A702 -66*+*7?6*7=9O;*+672OA7E6;*+672172?B=+0=6*70: 7?;A7=07+21P+*=6AA17,20A72, 027= -+1 =6AA1:02+40 .,90+ KZ,5M0 ,!“ #$: T*+11 N. TA+272, 027;A6726,*0A?6?*026;*+6721P*+?+*6* B;6 K1X 021 ;*+6721 +P04720101M2672 +P -6 _?;. P0?7AB P*+?626*072, ;6;70E6 ;*+672 +P62=6* W5,/66 .N,!“ #$: J*M=M*6 +P -6 D1=/-+?+A+, P*+? *+672 51;%A01?0 ?6?*026 +P*6*6VM7176: ()18!5()836 ?!6 75520,FGG#,!$:%G# H %G; D,9*0216- X,!“ #$: 9A+0A N+;+A+,B .20AB171+P -6 +618!/)18)# 1$) 226* D6?*026 Z*+6+?6: ,1)!01!,FGG#,!$*:%!F% H %!F!“ %02B72, A0*,6 1=0A6+46*O;*+7+2 +P -6 1MM27 +P K (%) K (+).NZ 1B2-016: KX3J/6,FGGG,IF:F%# H F%R“ %( X+?0 La,!“ #$: -#1“11126 $#1“)6 01 -+1P+* +46*;*+7+2 +P PM2=7+20A ?6?*026 ;*+6721: ()18)5 ()83691“#,FGG!,)$:R( H %GI“ %I NM*26* 9a,W6M1=- W,Q726*OY022 .D,!“ #$: 566*+A+,+M1 ,6266U;*6117+2 72 0 ?6?*026O;*+672O1;6=7P7= 1B16?:./“!)0 +/.2/)A,%RRR,(:!%F H !F!“ %R 3620-0AA0- LD,5M0*76216*M?7?M2+*60=747B+*6=+?7202*+-6 B601 .)18)# #6“/)6 =+?;0*6+618!/)18)# 1$) 021 ;+6270A P+* 16*+M6*=MA+171: %7$)0 *+672 ;*+=+A1:6U;*6117+2,;M*7P7=07+2,026*7S07+2: %16+C0,b6C a6*16B:5M?020 Z*611,FGG!“ F%)0126* Tb,L7?*+- Z,Z+1 )D: N-6 b0cO =7*06=0*76* +P B$!46)!$# 0!250)#!:-7,-OA646A 6U;*6117+2 026O60,626171 +P 01;0*0,726O%I# 020?06O%R“9/18*+7+2 +P ;*+E0*B+7=?6?*026 ;*+6721 P+* 1*M=M*0A ,62+?7=1 ./“!)0 ,1),FGG6AA X3,D0=E722+2 W: T*B10A 1*M=M*6 +P 0?0?0A702 4+A0,6O J-0E6* P0?7AB )c =-0226A: ,1)!01!,FGG#,!$+:IR( H RG!“#!R廖丹等:结核分枝杆菌膜蛋白的异源表达与纯化研究进展:d微生物学报 (FGG() ( (#)!“ #$%$ 0 )* 0;0? */ $* % 3-,I91*. JK,L.$8$;9);:)80*;/:10*$% ./;./$ J5 2.34 5+0,-#$,!AAB,% S,!“ #$5 T)4:*1/408 *1*)*1/4 /P);$% 14 *.$ P8? $?$5.637 8!),!AA!,:“QC E “QBG !F -.*/.$ K,W0R$/4 /P ;$;1/4 ;?;*$9; P/$/“#, !AAX, CBCA: C“C ECHXG !D 6(, !“#$5J;$978?04%/;1/4 /P 9$97 14 .*(!,“#,!AAX,()($,X E CAG !Q L$1:R$* OJ, !“ #$5Z*191+0*1/4 /P.$*$ ;.?; J35 (/Y *$9$ ;*07181+$ 14*$* 1; 14 6!“(:$+)(;1/414.*(!,$4;1*1;1/4 /P 0*$9$4;1*1$% .*(!,*0881+0*1/4 $U$981P1$% Y1*. Z9J 04% Z9,%,+“!;1/4 04% /*0881+0*1/4 04%1; /P /)*$./810;$ J P;$4; 6,!“ #$5 OU;1/4,*0881+0*1/4 /P *.$ Z:J 14.?88;04% 811%;:1; /P
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