华东理工大学硕 士 学 位 论 文第 t 页脂肪酶的固定化及其在苯甘氨酸拆分中的应用摘要本论文研究了 脂肪酶的固定化以及固定化脂肪酶用于苯甘氨酸的手性拆分反应， 确定 了 最 优 条 # 4以 后 的 工 业 生 产 奠 定 了 基 础 本论文 主要分 为两 个部分。 第一部 分主 要 研究了 脂 肪酶固 定化的 情况， 实 验表明 壳 聚 糖固定化酶有较高的活性和稳定性， 并且有较高的活性收率。 通过对反应动力学的 研究， 对该脂肪酶的性质有了 进一步的了 解，从而为以 后脂肪酶的利用奠定了理论基础。第二部分研究了 底物苯甘氨酸系列酷的 化学合成， 系统考察了固定化脂肪酶拆分苯甘 氨酸系列醋的 情况。 考察了反 应时N 1 、 反应p H , 反应温度等对拆分的影响。 在最优条件下， 苯甘氨酸甲醋的e e 关 键 词 : 脂 肪 酶 t 5 0 )。同 样， C a n d i d a r u g o s a 来源的 脂肪酶催化的 2 - 轻基酸的醋化 反应的对映体选择性依赖于酞基链的长度:如酞基链小于六个碳原子， 2 - 经基酸的S 一 异构 体 被酞基 化; 如酞基 链大于八个碳原子， R - 异构体 被 优先酷化4 7 1 1 .6 .3 . 通过 溶剂 的 变化 控制 手 性 选 择 性手 性 选 择 性 除了 依 靠 酶 和 底 物 外， 也 强 烈 地 依 赖 于 溶 剂 介 质 4 1 l o C a n d id a r u g o s 。 脂 肪酶催化的己 酸乙烯酷与甲醇的酷化反应中， 对映体选择性从在异辛烷中的 8 3 . 3到在异 丙醚中的 1 1 。另一个观察结果表明甲醇的 E值依赖于所使用的非手性酞基供体，如甲醇 用辛酸乙烯酷的对映体选择性的值为8 3 .3 ，而用己酸乙烯醋的对映体选择性的值为1 1 .4 .1 . 7 .本科题的研究现状及应用前景D 一 苯甘氨酸甲酷为酶法半合成氨节青霉素、头抱氨爷和头抱克罗等p 一 内酞胺类抗生 素 的 重 要 中 间 体 4 9 1国内生产 D 一 苯甘氨酸的企业有 1 0 家左右，原则上其生产装置可采用传统方法生产 D 一 对轻基苯甘氨酸。由于该法生产成本高，只有原上海嘉定徐行化工厂等个别企业使用 该法，年产量仅几百吨，也打算改用新工艺。F .O r s i n i 等报道了在有机溶剂中拆分苯甘氨酸的研究。枯草杆菌蛋白酶在 3 一 甲基一 3 - 戊醇中有效地拆分苯甘氨酸醋，这种苯甘氨酸酷是经丁酸三氟乙酷 N - 酞化的。酶的激活 靠“ p H调节” ， 使用硅藻土作为 载体 增加了 反 应速率和 对映体 选择率 ( e e 值从3 0 % 上升 到6 5 % ) 4 9 10第1 6 页华东 理工大 学 硕 士 学 位 论 文R o s e l l 等人用青霉素G酞化酶稳定的衍生物在水溶液中以合成路线拆分外消旋的苯 甘氨 酸(5 0 1 。 运用合成路线 拆分苯甘氨酸甲 醋的 主 要优点是有用的D 一 对映体 不参加反 应从 而回收，因为青霉素G酞化酶优先与L 一 异构体反应。 水是保持青霉素G酞化酶活性的必 要成分，然而最近研究表明天然的和固定化的青霉素 G酞化酶在不同纯的有机溶剂中是 有活力的 ( 如果控制酶的水合)。这可以通过维持反应体系的热动力学参数 “ 水活度” 在 。 .4 5 0 0 . 8 5 而获得。 通过控制水活度可以 使青霉素 G酸化酶在有机溶剂中发生酞化反 应而阻 止竞争性的水 解反应， 并且改 变了 疏水底物的 溶解性. A l e s s a n d r a B a s s o 5 1 1 首先 研究了膏霉素 G O R 化酶在纯的有机溶剂中的对映体选择性。通过青霉素 G酞化酶共价固 定化形式，一系列的处理使固定化酶的水活度值为0 .7 3 - 0 .7 7 。两份D , L 一 苯甘氨酸甲 酷 与一份4 - 一 苯甘氨酸甲醋反应，在2 4 小时内，仅生成相应的L - 酞胺， 而且一生成就沉 淀出 来。反应结束后酞胺与酶通过过滤除去，未反应的 D 一 苯甘氨酸甲 酷通过转变为盐酸 盐的形式很容易从有机溶剂中回收 ( 在有机溶剂中沉淀)。通过对未反应的 D - 苯甘氨酸 甲 醋的盐酸盐进行旋光分析，得出 对映体过盘值大于9 8 %.弓00叻一000刊00峭刊000门板坦比受00幻n食伟丫生职里 姗习盆城扣口旨0诗0000寸吕 吕 co 吕 坦 日 份 吕 to $ Q 乓场 掩 公 瘫 异 异的u 即! 山s u 山上 %华东 理工大学 硕 士 学 位 论 文第53页第5 1 页华东 理工大 学 硕 士 学00的乒000一护00幻户uJ忿巴.q三二亡山A口考0叮的丁-:u一一一一一 丁毛1盆冲ee孟tl千ee|泞1十“寸牛 nOO柑石二拐二9名000入扑一 塑七 “ 一 ， 班阮与忆杀壁00川刊000门00幻门000甘踢 8 40 吕 畏 吕 一 忍 显 、 sC ! 最_ _ 1_ 显卜冷 R N N .- -a a u e wws u e j l %华东 理工大 学 硕 士 学 位 论 文第55页致谢本论文是在导师欧伶副教授和魏东芝教授的悉心指导和关怀下完成的。几年来，两 位老师广博的知识、严谨的治学态度和活跃的学术思想给我留下了深刻的印象;并在实 验方案的设计、实验问 题的解决以 及论文的撰写方面提出了很多有益的建议。 在此， 对 两位老师在实验上和生活上给予我的教诲、鼓励和关心表达我最诚挚的谢意!在研究过程中， 还得到了周文瑜、 宋庆讯、粟武、余莹、 刘清海、朱妹、辛秀鹃、 王刚等老师的帮助和支持，在此表示深深的谢意! 同时衷心感谢实验室的硕士研究生顾 春盎、陶移文、常志远以及博士研究生罗宇、张立莹、杨柳、任宇红、王学东等在各方 面给予的真诚帮助!最后向生化所所有的老师和同学表示衷心的感谢!