原创性声明本人声明:所呈交的硕士学位论文，是本人在指导教师的指导卜 ，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名:日期:2 0 0 3年 5月 2 0 F l关于论文使用授权的说明木人同意学校有权保留并向国家有关部门送交学位论文的复印件，允许论文被查阅和借阅。同意学校及国家有关机构可以公布论文的全部或部分内可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文。沦文作者签名:指导教师签名:f - i 期:日期:吉林大学硕士学位论文含核酸孩基脂质体的制备与膜内分子识别研究提要新型脂质体的制备和分子识别是当前化学、材料和生物科学领域中相当活跃的两大研究课题。脂质体的双分子层结构及其特有的有序性和流动性，即可以作为生物膜的模型，探讨生物膜的功能;又可以作为药物载体，开发其在临床中的应用。腺pp 吟、胸腺啼咙是核酸的碱基，是D N A 形成双分子螺旋结构的分子基础。如果将腺p ac.r . 吟引入双亲化合物中，与天然磷脂一起制备混合脂质体受体，以含有相应碱基对或含有互补基团的药物作为底物，就能通过双亲分子的自 组织作用和受体与底物分子M的相互作用进行分子识别，通过分子识别，增强受体与底物在脂质体内的相互作用，进而提高脂质体的载药功能和对药物的包封率，为制备脂质体药物制剂提供理论和实验依据。本工作以腺A ,11 吟为原料，以腺op 吟的活性部位N “ 和9 位作为双亲性长链的引入位点，设计、合成了9 - 1 2 烷基腺喋吟，9 一 辛烷基腺嗓吟三甲基澳化按，N “ - 1 4 酞基一 9 一 辛烷基一 腺嗓吟三甲基澳化钱这一系列的双亲性化合物，利用核磁共振、元素分析、 透射电镜和紫外/可见分光光度计对其化合物的结构和形成的聚集体系统的结构进行了表征，该系列化合物都是未见报道的化合物。先将卵磷脂和双亲性化合物分别配制成一定浓度的C H C 1 : 标准溶吉林大学硕士学位论文液，在制备脂质体时，用移液管各取2 m l 卵磷脂和受体的标准溶液用氮气吹干，再加入适量的水用超声波振荡3 h 得脂质体溶液，定容为o 0 m l o分子识别:以胸腺P ? - 睫,氟尿It , 绽、巴比妥酸、核黄素、胸腺晾Gai t 衍生物为底物，通过紫外吸收光谱研究了受体脂质体与底物水溶液之间的分子识别。发现几个体系中底物分子的紫外吸收在监测了一段时间后都有不同程度的降低。又以胸腺啼P; t 及其衍生物为底物，以受体脂质体和底物脂质体为研究对象，也出现了相似的结果。我认为是底物与受体间的氢键作用使底物分子产生了减色效应。从而引起了紫外吸收的降低.这说明目标受体与底物通过互补基团上的氢键作用在脂质体内进行了分子识别。总之，本文设计合成了以系列行的含碱基双亲性化合物，并通过透射电镜的方法证明了其聚集的形态，以及其在脂质体中与各种底物分子都能进行较好的分子识别，可以证明该系列化合物作为脂质体包埋药物能提高载药率，延长药物的释放时间，为脂质体包埋药物的新方法提供了必要的理论依据。吉林大学硕士学位论文第一章 前言一 脂质体的研究进展a 71 . 1 . 1脂质体的概念脂质体( l i p o s o m e s ) 最初是由英国 学者B a n g h a 。 和s t a n d i s h 将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。 磷脂分散在水中自 然形成多层囊泡， 每层均为脂质的双分子层; 囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分 子 层厚 度 约4 n m， 后 来 将这 种具 有 类 似生 物 膜 结 构的 双分 子小 囊 称为 脂 质体。 脂 质 体 根 据其 结 构 所包 含的 双 层 磷 脂 膜 层数 可分 为单 室脂质体和多室脂质体，含有单层双层磷脂膜的囊泡称为单室脂质体，含有多层双层磷脂膜的囊泡称为多室脂质体。 般粒径小于2 0 0 n m 的称少 单 室 脂 质体 ， 粒 径 在2 0 0 - 1 0 0 0 n m 之间 的 单 室 月 颧体 称 为 大 单 室 脂 质体，多室脂质体的粒径在 1 1 1 m 至5 a m 之间。 脂质体研究是当前一个十 分 活 跃的 领 域 。 脂 质 体 最 早 是 指 天 然 脂 类 化台 物 尽 浮 在 水中 形 成 的具有双层封闭结构的泡囊， 现在也可以山人工合成的磷脂化合物来制备。随着膜模拟化学的发展，人们在水溶液中用超声等方法处理表面活性剂分子、也获得了与脂质体结构相同的泡囊( v e s i c l e ) ，一般称为表面活性剂泡囊。由于结构相同，体与泡囊的研究主要集中在三个领域常与脂质体一起研究。当前脂质:模拟膜的研究;药品的可控释放和在体内的靶向给药; 在体外培养中将基因和其他物质向细胞内的传递。近年，一些专门从事脂质体开发的公司相继成立， 用脂质体包裹的抗癌药、 新疫苗、 其他各种药品、 化妆品、 防晒农药也开始上市。吉林大学硕士学位论文6 0 年代末R a h m a n 等人首先将脂质体作为药物载体应用。 近年来，随着生物技术的不断发展， 脂质体制备工艺逐步完善; 脂质体作用机制进一步阐明，加之脂质体适合体内降解、无毒性和无免疫原性 ，特别是大量实验数据证明脂质体作为药物载体可以提高药物治疗指数降低药物毒性和减少药物副作用， 并减小药物剂量等优点。因此. 近年来脂质体作为药物载体的研究愈来愈受到重视. 这方面的研究进展非常迅速。 1 9 8 0 年， 第一个脂质体包裹的药物在美国进入了临床试验。1 0 家 公司向F D A 提出申 请1 4 个 脂 质 体 包 裹的 药 物， F D A 已 批 准 对它们进行临床试验，如脂质体公司( T L C ) 的阿霉素脂质体、顺铂脂质体，还有施贵宝与其合作的两性留素 B * 脂质体等。不难看出随着脂质体全盛时期的到来， 生物技术、 免疫调节、 遗传工程等各个领域之间的相互渗透，脂质体在生物医学领域中将倍受青睐。1 . 1 . 2月 旨 质体的作用特点脂质体( l i p o s o m e s ) 是一种定向药物载体， 属子靶向给药系统( t or g e t i n g d r u g d e l i v e r y s y s t e m ) 的一种新剂型。它具有类细胞结构，进入体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布、 使药物主要在肝、 脾、 肺和骨骼等组织器官中蓄积， 从而提高药物的治疗指数、 减少药物的治疗剂量和降低药物的 毒性。 因 此， 脂质体 在许多 疾 病尤其是癌症的治 疗中 显示了明显的优越性。脂质体还具有生物膜的特性和功能， 使它不仅作为一种新剂型应用于疾病的治疗和诊断中，而且在生物物理、生物化学、吉林大学硕士学位论文免疫学研究及免疫诊断等许多领域中都有应用。1 . 1 . 3 脂质体剂型的特点3 0 1脂质体可以包裹脂溶性和水溶性两种类型药物， 它是具有多种功能的定向性的药物载体。它具有如下特点:1 .制备工艺简单，一般药物都较容易包封在脂质体中。2 .水溶性及脂溶性两种类型药物都可包裹在同一脂质体中，药物的包封率主要与药物本身的脂水分配系数及膜材性质有关。3 .月 旨 质体本身对人体毒性小，并且脂质体对人体无免疫抑制作用。4 .在体内使药物具有定向分布的靶向性特征。0 .可以制成免疫脂质体，根据靶分子特性将脂质体运送到特定的组织中，与抗体或受体作用释放药物。6 .药物包裹在脂质体中是非共价键结合，而有些药物载体是以共价键与药物结合进入体内后由共价键结合的药物不易与载体脱离， 影响药效，而脂质体中的药物进入体内可在指定部位完全释放出来;肌内注射和皮下注射脂质体首先进入淋巴管， 最后进入血液循环并具有长效作用，脂质体还可在肺内， 心脏或关节腔等部位注射， 增加隔室靶向性: 脂质体还可以眼用或皮肤给药等局部给药，具有促进药物吸收等作用特点。吉林大学硕士学位论文7 .脂质体静脉给药时，离开血管进入细胞间质的机会很小;经皮下或腹腔注射的脂质体主要进入局部淋巴结中， 只有粒径较小的脂质体刁从肝等器官的不连续血管的窦状隙进入细胞间质。 进人体内的脂质体主要被网状内皮系统的巨噬细胞和血中的单核细胞吞噬。8 .药物被包封于脂质体中，能够降低药物毒性，增强药理作用。9 .脂质体制剂能够降低药物的消除速率，延长药物作用时间，增加药物的体内外稳定， 这样就可以降低由于药物浓度过大对人体造成的损害。1 . 1 . 4 脂质体的靶向性3 0 1靶向性是脂质体作为药物载体最突出的 特征，脂质体的 靶向 性有四种类型:( 一) 被动( 天然) 靶向性这是脂质体静脉给药时的基本特征， 是由于脂质体进人体内即被巨噬细胞作为外界异物吞噬的天然倾向产生的体内分布特征。 一般的脂质体主要被肝和脾中网状内皮细胞( p h ag o - c y t i c c e l l s ) 吞噬， 是治疗肝寄生虫病、 利什曼病等网 状内 皮系统疾病理想的药物载体。 利用脂质体剂型包封药物治疗这些疾病可显著地提高药物的治疗指数，降低毒性，提高疗效。脂质体的这种天然靶向性也被广泛用于肿瘤的治疗和防止肿瘤的扩散和转移。( 二) 物理和化学靶向性这种靶向性是在脂质体的设计中， 应用某种物理因素或化学因素的改变， 例如用药局部的p H 、 病变部位的温吉林大学硕士学位论文度等的改变而明显改变脂质体膜的通透性。 引起脂质体选择性的释放药物。目前利用物理靶向性设计最成功的例子是温度敏感脂质体( t e mp e r a t u r e - s e n s i t i v e l i p o s o m e ) ， 这种 脂质体 是 使 用具 有一定的 相变温度的脂质混合物作为膜材，或使用具有 4 1 至 4 2 相变温度的合成磷脂作为膜材， 使所制备的脂质体相转变温度也在4 1 左右 . 在热疗机对肿瘤局部的作用下， 当温度敏感脂质体进入肿瘤区的毛细血管床时， 脂质体达到液晶态相变温度，导致脂质体迅速完全地释放药物，使血管内外的药物浓度达到平衡。这种物理靶向性不需要脂质体离开毛细血管。W e i n s t e i n等证明，使用温度敏感脂质体，可使标记的甲氨蝶吟( H - M T x ) 在局部升温的肿瘤区的摄取量增大 1 0 倍以上，并抑制肿瘤的生长。 有人将局部升温放疗和化疗结合起来， 其治疗效果更好。某些弱离子性药物如甲氨蝶吟等包封在脂质体中。 .当其进入体内在肿瘤的低p H 局部，可以选择性地释放药物。 这种受p H 影响释放药物的脂质体叫p H 敏感脂质体。( 三) 转移靶向性这种靶向性是采用封闭网状内皮系统或减少网状内皮系统的摄取。如用胶体粒子阻断网状内皮系统的吞噬作用。亦可预先注射空白 脂质体， 使肝脾摄取脂质体呈饱和状态， 然后再给药物脂质体以增加非网状内皮系统的摄取。( 四 ) 主 动 靶 向 性 这 种 靶 向 性 是 在 某 种 脂 质 体 上 。 联 接 一 种 识 别 分子即所谓的配体。通过配体分子的特异性专一地与靶细胞表面的互补分子相互作用。而使脂质体在靶区释放药物。目 前已有人将几种吉林大学硕士学位论文不同类型的配体联接到脂质体的表面， 形成不向类型的配体改进的脂质体。 这些不同类型的配体有:糖、植物凝血素、月 太 类激素、小半抗原、 抗体和其它蛋白 质，联接不同配体的脂质体， 对不同的受体细胞有专一的靶向性。因此、我们可以根据给药的不同需要，来选择脂质体的配体。 例如将脂质体表面组装上从某种癌细胞制得的单克隆抗体，由单克隆抗体给脂质体导向，使脂质体只和这种癌细胞产生特异性结合达到靶向 给药的目 的。有人从C H !, / H e 小鼠 乳腺癌细胞制得的对这种癌细胞有特异性亲合力的I g m 型单克隆抗体， 对放线菌素。 脂质体进行表面修饰。 体内实验表明， 这种脂质体能选择性地与抗原阳,险癌细胞结合， 并显示出远较同剂量