第10卷 第3期1997年8月同 位 素Journal of IsotopesVol . 10 No. 3A ug. 1997血浆心钠素(ANF)放免分析试剂盒的研制苏静贤 侯惠仁(中国原子能科学研究院同位素研究所,北京102413)采用氯胺T(Ch2T)法对人心钠素( 2hAN F,以下简称AN F)进行125I标记,用Sephadex G50柱分离纯化,得到比活度 10 MBq? g、 放化纯度 90%、 与过量抗体结合率为(7881)%的125I2AN F。建立了稳定的冻干系列标准及简便、 快速的分析方法。试剂盒的标准曲线范围为653 250pmol?L ,在曲线范围内测定人血浆的平均回收率为(9314115)% ,高值血浆稀释相关系数r=01999 201999 8,灵敏度为17 pmol?L ,批内变异系数为(312415)% ,批间变异系数为(311612)% ,非特异结合率为(119415)%。健康人血浆的AN F含量正常值为122102418 pmol?L(xs,n= 97)。关键词 心钠素(AN F) 放免分析 试剂盒心钠素(Cardinatrin)亦称心房利钠因素(A trialN atriuretic Factor,简称AN F)。 2hAN F 由28个氨基酸组成,相对分子量为3 080. 5。 它主要分布在心脏,也广泛分布在人体的肺、 肾上 腺等多种器官中13。1984年以来,心钠素在人体内的分布、 释放、 代谢、 受体功能和调节等方 面研究及测试方法研究取得很大进展3, 4,特别是用放免分析测定人血浆中的AN F含量,为 临床心血管疾病研究和治疗监测提供了有效依据1, 5, 6。目前,AN F放免分析方法有平衡法和非平衡法两种5, 6。本文拟建立平衡分析法,对标记物、 标准品、 抗血清的介质、反应温度、 反应 时间和反应体系进行条件试验,旨在研制出快速、 灵敏、 操作简单、 准确测定人血浆中AN F含 量的试剂盒。1 实验材料111 主要试剂 碘化钠(N a125I)溶液:放化浓度为317714MBq?mL , pH8- 10,中国原子能科学研究院 产; hAN F原料:人工合成,相对分子量3 08015,色谱纯(98% ), SIGMA公司产品;第二抗体: 滴度14110,中国原子能科学研究院产;兔抗AN F血清:亲和常数K= 1109Lmol- 1,工作滴度15104;表面活性剂X2100, Sephadex G50,抑肽酶(1104U?mL),聚乙二醇(相对分子量为6 000)等均为国产或进口分装。112 主要仪器Ratemeter P7973放射性纸色层扫描仪(英国PANAX公司), L KB 1260M ultigamma 11收稿日期: 1996208222 修改稿收到日期: 1997201210放射性 计数器(芬兰WALLAC公司),LD5210离心机(北京医用离心机厂), STEPPER 411 分装器(瑞士),放射性电离室(中国原子能科学研究院)。2 实验方法2. 1 125I-ANF的制备AN F、Ch2T、N a2S2O5均用012mol?L pH7. 4磷酸盐缓冲液(简称PBS)溶解。取一小玻璃 瓶,加入AN F溶液10L(内含AN F 5g)、N a125I 92. 5MBq和PBS 100L混匀;再加入Ch2T溶液30L(内含Ch2T 20g),反应5 m in,然后加入N a2S2O5溶液30L(内含N a2S2O5300g)中止反应。标记后的混合液取5L点于W hatman 1号层析纸,其余溶液移入Sephadex G50柱进行纯化,用015mol?L HA c淋洗。标记液纸层析扫描谱示于图1,淋洗曲线 示于图2。根据标记率和投料量计算125I2AN F比活度。图1 125I2AN F标记液纸层析扫描谱图2 125I2AN F淋洗曲线212 ANF标准品的制备 用0105 mol?L pH714 PBS(019%生理盐水配制,内含抑肽酶1105U?L、 表面活性剂X2100 110 mL?L、 牛血清白蛋白1 g?L、N aN3015 g?L)将AN F配制成130、325、650、1 300、3250、6 500 pmol?L的标准品溶液,以每瓶015 mL分装冻干, 4存放。213 抗血清工作液制备 兔 抗AN F血清用0105 mol?L pH7. 4 PBS溶液(内含牛血清白蛋白1 g?L、N aN30. 5 g?L、 少量伊文思兰)稀释并作试验,取B0?T为35%50%相应浓度的抗血清配成工作 液, 4存放。2. 4 试剂盒组成 由系列标准品、125I2AN F、 抗血清、 温育液(0105 mol?L pH7. 4 PBS溶液(内含抑肽酶1105U?L、 表面活性剂X2100 110 mL?L、 牛血清白蛋白1 g?L、N aN30. 5 g?L)、 抗凝剂、 分离 剂以及说明书组成。215 操作方法按说明书配制,表1程序操作。4反应1724 h后,加入分离剂,混匀后以3 000g离 心15 m in,弃上清液,测沉淀放射性计数率。141 第3期 苏静贤等:血浆心钠素(AN F)放免分析试剂盒的研制表1 ANF放免分析程序L 试 管总T管试剂NSB管血样NSB管零标准管标准管样品管温育液200100100标准品100样 品1001)100125I2ANF100100100100100100抗ANF血清100100100注: 1)任意血浆3 结 果311 125I-ANF质量鉴定 统计1994、1995两年20批125I2AN F制品,其比活度为7141419MBq? g,放化纯度为(9096)% ,与过量抗体(10倍于使用抗体浓度)结合率为(7881)% ,非特异结合率为(119415)% ,零管结合率为(38155511)%。125I2AN F冻干品经37考验2周,然后于4存放,测定其存放期间的N SB、B0?T,计算 取代比,以观察125I2AN F的稳定性。结果列于表2。表2 125I-ANF的冻干品37考验2周的实验结果4存放时间?dNSB?%B0 T?%取代比1)1772)3. 20. 455. 14. 27. 50. 3334. 20. 244. 72. 39. 70. 2632. 70. 238. 91. 69. 30. 4注: 1)零标准管结合率与最大标准管结合率之比; 2)冻干后直接于4存放312 标准品稳定性 冻干系列标准品在4存放12周及37存放2周的实验结果比较列于表3。表3 冻干系列标准品稳定性比较存放条件标准品浓度?pmolL- 165162153256501 6503 250412周的BB0?%871173145911441920151311372周的BB0?%861071196213431321141210313 抗血清稳定性 取- 20条件存放的抗血清冻干品溶解,溶解后的液态抗血清分别于室温、37存放2 周,做试验后再于4存放。测定其存放不同时间的零管结合率,与直接从- 20取出冻干品241同 位 素 第10卷 溶解的结果比较,结果列于表4。表4 液态抗血清稳定性存 放 条 件4存放时间?dB0 T?%冻干品, - 2027050. 8液态、 室温2周后4120(210)1)50. 8?(51. 0)液态、372周后4120(210)5111?(5111)液态、4120(210)4811?(5116)注: 1)括号内数据为对应条件下不同存放天数及其相应的B0 T值314 ANF标准抑制曲线以各标准管的B0?T为纵座标,标准品浓度的对数值为横座标作图,得到AN F标准抑制图3 AN F标准抑制曲线曲线(图3)。315 方法学鉴定 按测定零标准均值减2倍标准差的方法计算 本试剂盒的灵敏度为17 pmol?L ,回收率为9314%115% ,批内CV为312%415% ,批间CV为311%612% ,N SB为119%415%。取 一血样,加入一定量的标准AN F,然后对样品进 行稀释试验,在曲线范围内其稀释倍数和AN F 测定值的相关系数为01999 201999 8,关系式为y= - 74+ 3 493x(x为稀释倍数,y为AN F浓 度(pmolL- 1)。316 正常参考值 通过医院97例健康人(年龄在2259岁)血 浆样品分析,正常参考值xs= 122. 02418pmol?L ,且性别之间无明显差异。317 试剂盒的稳定性 试剂盒全部组分分别置于冰箱(28)、 室 温(2025)、37恒温箱条件下存放,不同存 放条件的分析结果列于表5。表5 ANF试剂盒稳定性存放条件NSB?%B0 T?%ED?pmolL- 1ED20ED50ED80冰箱(13周)31001841182171 628161061046219291912111814 室温(2周)31201741151191 60711741645618201911915616 室温(3周)31401738191131 6721456184691716151231251237(2周)41101438141151 66019741847211181412315610341 第3期 苏静贤等:血浆心钠素(AN F)放免分析试剂盒的研制4 讨 论(1)人的心钠素有 、 、 三种,都具有生物活性,其中以 活性最强,但生理半衰期只有215 m in。 心钠素分子中第105和121位有两个半胱氨酸,经一个二硫链组成一环状结构,这是维持其生物活性所必须的。在125I2AN F制备、 标准品和试剂盒分析方法研究时都要从保持 2AN F的活性着手。试验证实,制备125I2AN F时,采用Ch2T法,取可以标记范围的氧化剂量最 少、 反应时间最短、 标记纯化以HA c溶液作淋洗剂为最佳;液态标记物尽快冷冻干燥能保持标 记物的高活性。系列标准中加入抑肽酶或苯甲脒抑制剂,能延缓 2AN F的降解。(2)参照卫生部对试剂盒质量要求的可测限、 可测范围、 特异性、 正确性、 稳定性、 精密性等指标内容作评价,或以Cerceo效点系统打分法打分,本心钠素试剂盒都属较优水平。试剂盒 在37考验两周后于4存放的试验结果说明,经过自然温度运输后到达用户手中,试剂盒 仍稳定有效。(3)正常人血浆中 2AN F参考值数据,因采用的试剂盒分析方法不同而各异,非平衡法所得正常值较平衡法低57。同时在加入分离剂后,测量的数值与室温放置的时间长短有关。本文中的正常参考值是采用平衡法分析的结果。参 考 文 献 1 汤 健,谢翠微编著 1 心钠素 1 北京:北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社, 1989136421 2 A ckermann U. Structure and Function of AN F. Clin Chem, 1986, 32: 241. 3 N eedleman P. A triopeptin Biochem ical Pharmacology.Fed Proc, 1986, 45: 2096. 4 Tang J, Fei H, Xie CW , et al . Characterization andLocalization ofA triopeptin in RatA trium. Peptides, 1984, 5: 1173. 5 TakcshiN , Haruhiko S, Yasuhiro Y, et al . Radioi mmunoassayofA trialN atriure