微生物学通报 JUN 20, 2011, 38(6): 908 915 Microbiology China 2011 by Institute of Microbiology, CAS tongbaoim.ac.cn 基金项目：广东出入境检验检疫局科研项目(No. 2007GDK06) * 通讯作者：Tel: 86-20-38290911; Fax: 86-20-38290422; : chenriqtc.cn 收稿日期：2010-10-08; 接受日期：2010-12-14 简 报 建立液相芯片方法检测鉴别结核分枝杆菌复合群、 鸟分枝杆菌与副结核分枝杆菌 陈茹1* 毕英佐2 刘志玲1 周仲芳1 刘志辉3 陈芳1 赵吟1 (1. 广东出入境检验检疫局 广东 广州 510623) (2. 华南农业大学 广东 广州 510642) (3. 广州市胸科医院 广东 广州 510095) 摘 要: 运用液相芯片技术原理, 以分枝杆菌菌种(群)特异基因序列 IS6110、IS1081、IS1245 和F57 为目标基因, 设计筛选 4 套扩增引物和杂交探针, 建立同时检测鉴别结核分枝杆菌复合群、 鸟分枝杆菌和副结核分枝杆菌的四重液相基因芯片检测方法。对 13 种共 54 株分枝杆菌菌株以及 23种常见微生物样品的检测结果显示, 四重液相芯片方法可特异检测鉴别目标菌种(群), 与其它分枝杆菌菌种或微生物无非特异交叉反应; 检测敏感性达 2.11012.5102基因拷贝或 0.060.74 fg DNA; 组内检测变异系数和组间检测变异系数均10%。 采用四重液相芯片方法从临床结核疑似人痰样和牛组织样品中检出结核致病菌, 检出率分别达 75.6% (99/131)和 94.9% (37/39), 显著高于培养法(38.9%和 53.8%)。对副结核疑似临床样品的检测试验结果显示, 四重液相芯片方法与荧光PCR 方法的阳性符合率为 83% (24/29)。 对四重混合模板的检测试验结果显示该液相芯片方法可鉴别不同菌种混合感染。四重液相芯片方法的检测周期1 d, 其中对纯化 DNA 模板的检测时间可在23 h 内完成。 关键词: 液相芯片技术, 结核分枝杆菌复合群, 鸟分枝杆菌, 副结核分枝杆菌 Development of a liquidchip assay for simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis complex and M. avium and M. paratuberculosis CHEN Ru1* BI Ying-Zuo2 LIU Zhi-Ling1 ZHOU Zhong-Fang1 LIU Zhi-Hui3 CHEN Fang1 ZHAO Yin1 (1. Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou, Guangdong 510623, China) (2. South China Agriculture University, Guangzhou, Guangdong 510642, China) (3. Guangzhou Chest Hospital, Guangzhou, Guangdong 510095, China) 陈茹等: 建立液相芯片方法检测鉴别结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌与副结核分枝杆菌 909 http:/journals.im.ac.cn/wswxtbcn Abstract: A microsphere-based LiquidChip assay was developed for rapid and simultaneous detection of Mycobacterium tuberculosis complex, Mycobacterium avium and Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP). Four sets of oligonucleotide primers and probes which respectively targeted at IS6110, IS1081, IS1245 and F57 specific genes of mycobacterium were selected to establish the quad- ruplex assay. The quadruplex assay specifically identified target strains from a total of 54 strains of 13 species of mycobacterium, and 23 species of non-mycobacterium microorganisms were all detected as negative. The sensitivity on detecting cloned plasmid DNA by the quadruplex assay was 2.11012.5102 genomic copies or 0.060.74 fg DNA per reaction. The intra-assay and inter-assay variations of the quadruplex assays were both lower than 10%. The assay detected 75.6% (99/131) and 94.9% (37/39) positive from TB suspected human sputum samples and bovine tissue samples respectively, compared to culture methods that detected 38.9% and 53.8% positive from human and bovine samples respectively. The quadruplex assays also detected 24 MAP positive from 29 bovine blood specimens detected as positive by real time PCR specific for MAP. The tests on quadruplex mixed templates showed that the assay could identify mix infections. Clinical detection by the assay could be finished within one day, and the detection on purified DNA template could be completed in 23 h. Keywords: LiquidChip technique, M. tuberculosis complex, M. avium, M. a. subsp. paratuberculosis 结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tubercu-losis complex, MTC)是引起人与哺乳动物结核病(Tuberculosis, TB)的一类致病性分枝杆菌的总称, 包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M. tuberculosis, MT)、 牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis, M. bovis, MB)、非洲分枝杆菌(M. africanum)和田鼠分枝杆菌(M. microti)等菌种。其中, 主要感染人与家畜并致病的是 MT 和 MB。除 MTC 外, 自然界还存在多种致病性非结核分枝杆菌(NTM), 鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium, MA)和副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, MAP) 是其中对人畜感染普遍、危害突出的致病菌种。MAP 引起动物副结核病(Paratuberculosis), MA 感染禽类引起禽结核、感染猪等家畜引起呼吸道和消化道病症12, 同时 MA也是医学界重点关注的感染病菌, 引起非典型肺炎、艾滋病并发感染、皮肤感染等病症35。除对人畜健康造成直接危害, 鸟分枝杆菌和副结核分枝杆菌的感染还干扰结核病的诊断, 造成结核假阳性, 影响结核病防控、根除以及进出境动物检疫。 快速准确的病原菌检测鉴定技术是有效防控人畜结核、副结核以及鸟分枝杆菌感染的重要技术支撑, 由于 NTM 对抗结核药物耐药, 准确鉴别 MTC与致病性 NTM 在治疗方面还具有重要意义。分枝杆菌生长缓慢, 菌种之间同源性高, 形态结构以及生化特性相近, 采用细菌分离培养、镜检以及皮内变态反应等传统诊断技术具有周期长、敏感性低、难于准确鉴定菌种以及假阳性率高等弊端。20 世纪90 年代以来, 国内外陆续开展以分枝杆菌基因组特异核酸序列检测为基础的检测技术研究, 建立了聚合酶链式反应(PCR)、荧光 PCR、PCR-RFLP 以及固相基因芯片等多种方法, 在检测速度、敏感性、准确性等方面均超越传统检测方法。 液相芯片(Liquidchip)技术又称微球悬浮芯片(Microsphere-based suspension array)技术, 是在流式细胞技术和芯片技术基础上开发的新一代高通量分子诊断技术平台, 能实现多目标高通量快速检测67, 近年在国际临床高通量检测技术领域备受关注。液相芯片技术的核心是乳胶微球包被和荧光色编码以及液相分子杂交。该技术以直径为5.6 m 的聚苯乙烯乳胶微球作为基质, 每种微球带有独特的荧光色编码, 可分别偶联不同的核酸或蛋白探针, 与待检物分子通过碱基配对原理(核酸检测)或抗原-抗体、配体-受体反应原理(蛋白检测)进行液相杂交反应从而达到检测目的。本文报道应用液相基因芯片技术原理建立新型检测方法, 实现同时检测鉴别 MTC、MA 和 MAP 等多种致病性分枝杆菌。 910 微生物学通报 2011, Vol.38, No.6 http:/journals.im.ac.cn/wswxtbcn 1 材料与方法材料与方法 1.1 菌种与核酸材料 灭活结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、鸟分枝杆菌以及草分枝杆菌(M. phlei)等其它 9 种分枝杆菌样品, 均源自美国标准菌种保藏中心(ATCC)标准菌株, MAP标准菌株购自中国兽医与药品监督所(CVCC)。卡介苗(BCG)冻干粉为兰州生物制品研究所产品(冻干皮内注射用卡介苗, 批号 20000912)。MT 分离株(15 株)核酸样品由广州市胸科医院提供; MB 分离株(7 株)核酸样品由华中农业大学馈赠; MAP 分离株(8株)灭活样品由吉林农业大学馈赠, MA 分离株(3 株)核酸样品由广东出入境检验检疫局技术中心保存。 鼠伤寒沙门氏菌(CMCC 50115)、奇异变形杆菌(CMCC 49003)、威尔氏李斯特菌(ATCCF 35897)、格式李斯特菌(ATCC 25401)、表皮葡萄球菌(CMCC 26906)、产气肠杆菌(CMCC 45103)、宋内氏志贺氏菌(CMCC 51334)、乙型溶血链球菌(CMCC 32210)、绿脓杆菌(CMCC AS1.0212)、大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、肠致病性大肠埃希氏菌(ATCC 43887)、产肠毒素大肠