摘要研究目的探讨腱组织提取物对A D S C 增殖和向肌腱细胞方向分化的影响，从而为肌腱组织工程及其最终应用于临床提供理论依据。研究方法从3 周龄S D 大鼠腹股沟脂肪垫分离出脂肪组织，通过I 型胶原酶消化法分离干细胞，接种于含有胎牛血清的D M E M 培养基中分离传代。每日以倒置显微镜观察细胞形态及生长情况，M T T 法绘制A D S C 生长曲线。经鉴定后，取第三代A D S C 分成实验组和对照组2组，利用腱组织提取物处理实验组A D S C ，H a l l l ( s 液处理对照组细胞后继续培养观察。采用M T T 比色法进行增殖活性比较，I 型胶原免疫细胞化学染色检测成肌腱分化情况以及R T - P C R 检测肌腱发育相关基因( C o l l a g e nI 、C o l l a g e n I 基因) 的表达。研究结果原代细胞接种4 6 小时后即可见沉降贴壁，7 8 天左右可见大量增殖，按一定方向性排列，呈漩涡状或束状，传代后细胞增殖迅速，生长稳定。腱组织提取物诱导后，M T T 实验显示A D S C 增殖活性并未发生明显改变，与对照组间没有统计学差异( p o 0 5 ) 。行I 型胶原免疫细胞化学染色显示：实验组为阳性，对照组阴性；l m P C R 检测显示肌腱发育相关基因( C o l l a g e nI 、C o l l a g e n I I I 基因) 表达明显增加( p o 0 5 ) C O n c l u s i o n s ：1 T e n d o nt i s s u e se X 衄c t sc a I ln o tC h a n g em ep r o l i f e r a t i o na c t i 讥t ) ro fr a t A D S C 2 T e n d o nt i s s u e se x 仃a C t sc a np r o n l o t er a tA D S Cd i 行昌r e n t i a t ei n t om et e n d o nc e l l s 1 ( E YW o R D St e I l d o nt i s s u e se 加徼t s ，a d i p o s e - d e r i V e dm e s e n c h y l I l a ls t e mc e l l ，p r o l i f e r a t i o n ，i h 佰暑r e l l t i a t i o n缩略词表- - - _ 一 缩略词英文全称中文全称一一一 A D S C sa d i p o s e d e r i v e ds t e mc e l l脂肪来源间充质干细胞D M E Md u l b e c c o sm o d j f i e de a g l em e d i u mD M E M 培养基P L Ac e l l sp r o c e s s e d1 i p o a S p i r a t ec e l l s抽脂处理后细胞P B SM T TD M S OB S AM S C sI m P C Rp h o s p h a t eb u 彘r e ds a l i n磷酸缓冲盐溶液3 - ( 4 ，5 一d i m e t h y l t h j a z o l - 2 - y 1 ) 2 ，5 曝哇蓝d i p h e n y l t e 仃a z 0 1 i u mb r o I m dd i m e t h y ls u l f o x i d c二甲基亚砜b o 痂es e r u ma l b u n l i n牛血清白蛋白m e s e n c h 弘m ls t e mc e l l s间充质干细胞r e V 盯s e 订a n s c 一州O np 0 1 弘n e r a s e逆转录聚合酶链式c h a i nr e a c t i o nD A Bd i a m i n o b e n 卤d i n e反应3 ，3 二氨联苯胺A L Pa l k a l i n ep h o s p h a t a s e碱性磷酸酶_ _ - - 一-V I硕+ 学位论文前言第一章前言弟一早日I J 百软组织损伤与修复在临床中极为普遍。美国每年运动损伤超过4 0 0 0 0 0 0 0 例，其中肌腱、韧带以及关节囊损伤约占4 5 。其中肌腱损伤尤为常见，全美每年需要手术治疗的肩袖损伤约5 1 0 0 例，跟腱损伤4 4 0 0 0 例，髌腱损伤4 2 0 0 0 例【l - 8 l 。而且由于人群年龄结构的改变以及肌腱组织的运动特性，肌腱损伤的发生率仍在不断上升中【l J J 。1 1 6 j 床上，尽管一部分手术方法取得了成功，但并不意味着其修复效果的完美。事实上，无论采用传统的或者改良的方法对受损肌腱组织进行修复都存在着诸多弊端。目前修复肌腱损伤的主要方法包括：直接缝合、肌腱转位、自体移植、同种异体移植和人工肌腱移植等。其中，直接缝合的要点在于通过坚强的缝合恢复腱组织的强度，但是由于一期修复后超出正常水平的张力负荷将引起慢性肌腱组织变性，有可能最终导致修复失败【1 0 】；肌腱转位后，也常常由于肌肉收缩牵拉、关节活动范围减小、神经血管损伤以及术后正常生物力学机制改变造成失败【lI 眩】；同种异体移植尽管在形态方面与自体腱组织相似，但长远来看仍会发生排斥反应；自体移植则不可避免的会造成供区附加损伤，且来源有限，因此在使用上仍存在局限性；人工合成材料不具有生物活性，移植后易引起异物反应，且伴随着时间的推移，移植物在体内逐渐降解将有可能产生对其他组织不利的副产物，远期效果欠佳。伴随着组织工程学概念的提出【1 3 l ，利用恰当的诱导因子干预干细胞并结合具有良好生物相容性的生物材料支架对受损后的肌腱组织进行修复将有望改善治疗肌腱损伤的现状。干细胞为一类具有自我更新能力和多向分化能力的细胞。近年来，由于对干细胞的研究及其所获得的进展引发了人们利用干细胞来实现组织再生的热情和努力。本世纪初，Z u k 等人发现了脂肪来源间充质干细胞【1 4 J 。由于其获取的简易性和来源的丰富性，脂肪来源间充质干细胞作为一种有吸引力并且确实可靠的干细胞，在众多干细胞应用中逐渐变得越来越流行。根据一些既往研究结果，脂肪来源间充质干细胞所显示出的在修复肌腱组织方面的潜能令人激动【1 5 以舢。干细胞的增殖和分化依赖于其所处的特殊微环境，而且越来越多的研究证明了各种理化因素刺激或特殊细胞微环境f 垤】对干细胞的增殖、分化等生物学行为起着重要的调节作用。通常情况下，干细胞的小生态环境与干细胞保持在一种相对稳定的状态。干细胞于小生境中进行自我更新，并在必要的时间向正确的方向进行分化；而小生境则一方面保护干细胞不受混杂信号的干扰，另一方面防止干细胞过度增殖而致瘤。近年来，研究干细胞与其细胞微环境间交互关系的研究越来越多，主要方法包括通过添加细胞因子改变细胞周围微环境及引入其他种类细硕十学位论文前言胞与靶细胞进行共培养等。2 0 0 4 年，G a u s t a d 等曾尝试利用大鼠心肌组织提取物诱导成体干细胞定向分化1 2 0 1 ，提出了一种有别于单纯添加细胞因子和细胞共培养的新途径。这种方法较之单纯添加细胞因子更为经济，比细胞共培养操作更为简便，培养条件要求相对宽泛，仿生学程度高，更为符合组织工程学的要求，而且可以和细胞共培养的诱导方法同时应用。2 0 1 0 年，P e m 等利用心肌提取物诱导脂肪来源间充质干细胞后，获得了类心肌样细胞【2 lJ ，进一步证实了这种方法的可行性。而目前，国内外暂未有关于利用腱组织提取物诱导干细胞向肌腱细胞定向分化的报道。本文利用腱组织提取物模拟一种特殊的细胞微环境，进而研究腱组织提取物对脂肪来源间充质干细胞增殖和分化的影响。2硕士学位论文材料与方法第二章材料与方法2 1 实验动物3 周龄健康雄性S D 大鼠：体重约1 8 0 2 3 0 9 之间，由中南大学实验动物部提供。饲养条件：温度2 4 2 7 ，相对湿度：5 5 6 0 。2 2 主要仪器设备3 7 饱和湿度细胞培养箱相差倒置显微镜荧光倒置显微镜空气震荡器台式离心机恒温摇床酶标仪电泳分析系统P C R 仪凝胶成像系统F o n n aO l 肿p u sO l y n l p u s中南大学湘雅二医院中心实验室提供 T h 锄oH v b a i dT h e 加oH v b a i dB I O R A DB I O R A DT h e m l oH v b a i dB I O R A D2 3 主要实验试剂D M E M 培养液S i 舯a胎牛血清G i b C o胰蛋白酶S i 鲫aI 型胶原酶S i 肿a胰岛素S i 鲫a地塞米松S i 舯a抗坏血酸S i 肿a小鼠抗兔I 型胶原抗体武汉博士德P v 9 0 0 0 二步法免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司。试剂盒内容：试剂：3 H 2 0 2 去离子水； 试剂l ：P o 帅e r H e l P 叫即用型) ；试剂2 ：e r o x i d 觞e 锄t i m o u s 折a b b i tI g G ( 即用型)3硕士学位论文材料与方法琼脂糖 1 0 m 咖l 溴化乙锭( E B )L a d d e r M a l 【e r5 0 T A E 电泳缓冲液6 D N A 载样缓冲液I A 提取试剂盒A M V砌妊酶抑制剂R T b u 缅。r d 】岍T a q 酶P B SH a n k sP e I l i c i l l i n - S 仃印t o m y c i n 双抗细胞裂解液1 a k a r aT 2 I k 孤aR I k a r a中南大学湘雅二医院中心实验室提供中南大学湘雅二医院中心实验室提供Q 认G E NB i o n u xB i o n u xB i o f l m 【赛百胜T a k a r a中南大学湘雅二医院中心实验室提供中南大学湘雅二医院中心实验室提供S i g m a中南大学湘雅二医院内分泌研究所实验室提供2 4 主要实验试剂的配制2 4 1 含l O 胎牛血清的D M E M 完全培养基的配制取1 0 m l 胎牛血清溶解于9 0 m l D M E M 培养基中，即可配成含l O 胎牛血清的D M E M 培养基，置4 冰箱中保存。2 4 20 1 I 型胶原酶溶液取1 0 0 m 出型胶原酶粉剂，加入1 0 0 l I I l lL 广D M E M 培养基，搅拌至充分溶解，置4 冰箱中保存。2 4 31 0 I I l 咖lE B 溶液：称取1 9E B ，加入去离子水1 0 0 m l ，充分搅拌使之充分溶解，转移至棕色瓶，室温避光保存。2 4 4 琼脂糖凝胶( 1 )取1 0 I I l l5 0 T A E ，稀释成5 0 0 | n l l 。取2 5 m l l T A E ，加入0 2 5 9 琼脂糖，电炉上煮沸，冷却至6 0 左右，加入5 山E B ，充分混匀。将温热的混合液加入到先放置好的凝胶板中( 防止气泡) 。静置4 5 分钟后可用于电泳。2 4 5M T T 溶液称取5 0m gM T T ，溶于1 0m lP B S 溶液中，使之充分溶解，终浓度为5m g m l ，4 过夜。0 2 2 岬滤膜过滤除菌，4 避光保存，两周内有效。4硕+ 学位论文材料与方法2 5 实验方法2 5 1 大鼠A D S C 的分