1活性炭联合大孔树脂分离纯化京尼平苷的研究作者：梁华正 李威威 彭玲西 李媛 乐长高【关键词】 活性炭摘要：目的从栀子黄废液中分离纯化京尼平苷。方法采用两步吸附分离法，即先采用活性炭从栀子黄废液中吸附分离京尼平苷，纯度可达 17.56%，然后再用 HPD100 大孔树脂进一步纯化京尼平苷。结果纯度可达 58.42%。结论该项工艺操作简单，为工业化生产京尼平苷打下基础。关键词：京尼平苷；栀子； 分离纯化Isolation and Purification of Geniposide from Gardenia Yellow Waste Liquid by Active Carbon and ResinAbstract:Objective Isolation and purification of Geniposide from Gardenia yellow waste liquid with double adsorb and purify were studied. MethodsFirst, used the active carbon to isolate geniposide from the liquid, then used HPD100 macroporous resin to purify it.ResultsThe finished 2products purity achieved 58.42%.ConclusionThis technology is simple and can be used for industrial production.Key words：Geniposide; Gardenia fruit; Isolation and purification栀子苷也称京尼平苷（geniposide） ，结构见下图左，是一种环烯醚萜葡萄糖苷，易溶于水，是栀子的主要药效成分，含量随产地的不同在 3%8%左右，可被 -葡萄糖苷酶水解为京尼平（结构见下图右） 。研究表明，京尼平苷对消化系统、心血管系统和中枢神经系统疾病均有显著疗效1 ，此外，京尼平苷还有一定的抗炎和治疗软组织损伤的作用。京尼平苷除了药用以外，在其它领域也得到广泛的应用，如可用作植物增产剂2 、生物检测剂3 和生物载体4 。随着对京尼平苷研究的不断深入，其应用前景将更加广阔。目前，京尼平苷的提取方法一般采用氯仿、无水乙醇等有机溶剂在索氏提取瓶中提取，得到栀子中总的活性成分栀子总苷，然后再上硅胶柱分离，用一定比例的甲醇、氯仿混合液洗脱，洗脱液在丙酮中进行重结晶得京尼平苷晶体，一般 100 g 栀子果中可分离得到 4.0 g 左右京尼平苷57 。I.H Pan 等8 采用双水相系统3从栀子中分离提取京尼平苷，该系统包括 PE62(20%乙烯氧化物和80丙烯氧化物的共聚物)、KH2PO4 和乙醇，通过实验发现， 100 g 栀子果实可得到近 8 g 京尼平苷，纯度可达到 77。大孔吸附树脂是 20 世纪 60 年代发展起来的有机高聚吸附剂，是一种吸附和筛选原理相结合的分离材料。近年来大孔树脂已逐渐应用于中草药有效成分的提取和中药新药的开发研制中，目前关于大孔树脂分离栀子中京尼平苷的报道较少，吕茂平等9用大孔树脂 D301R 分离栀子中京尼平苷，能与栀子黄色素等杂质较好地分离，收率在 65以上，但纯度未见报道。本项目利用活性碳联合大孔树脂吸附法，将京尼平苷较好地进行了分离，得到较高纯度的产品，且该方法具有低成本，易工业化扩大生产的特点。1 材料与方法1.1 试剂栀子（江西天顺生态农业有限公司） ；大孔树脂HPD100，HPD400 ，D301 （沧州宝恩化工厂） ；大孔树脂HZ801B， HZ801，HZ201 ，335，D301R，802，803（上海华震科技贸易公司） ；活性炭（200 目） （江苏省溧阳市活性炭联合工厂） ；栀子苷对照品（中国药品生物制品检定所，编号为110749200410）葡萄糖苷酶（Worthington Biochemical 4Corporation，3.4Umg1） ；0.132 mgml1 栀子苷对照溶液；0.5Uml1 葡萄糖苷酶溶液(用 pH=5.0的 0.1 mol/L 的乙酸缓冲液配制)；1% 的精氨酸溶液；其他试剂均为分析纯，所用水均为去离子水。1.2 仪器 UV751GD 紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)； HL1B 数显恒流泵（上海精科实业有限公司） ；BS223S电子天平（北京 Sartorius 仪器系统有限公司） ；LRH150Z 振荡培养箱（广东医疗器械厂） 。1.3 实验方法1.3.1 栀子黄废液的制备称取 50 g 栀子干果，用 10 倍量去离子水浸泡 12 h，过滤后取滤液，经树脂吸附栀子黄色素后的溶液，即为栀子黄废液。1.3.2 活性炭吸附京尼平苷1.3.2.1 活性炭的预处理将活性炭（ 200 目）用无水乙醇浸泡2 h，然后再用去离子水反复冲洗，备用。1.3.2.2 活性炭分离京尼平苷称取 50 g 活性炭加入 500 ml5栀子黄废液中，室温搅拌吸附 5 h 后，抽滤，得活性炭。用 500 ml去离子水冲洗活性炭，再用 500 ml10%乙醇溶液冲洗，将洗涤后的活性炭用 200 ml 无水乙醇洗脱，抽滤，滤液经低温干燥后即为京尼平苷粗品。1.3.3 大孔树脂纯化京尼平苷1.3.3.1 树脂预处理将大孔树脂用无水乙醇浸泡 2 h 后，用去离子水反复冲洗，备用。1.3.3.2 树脂纯化京尼平苷将所得京尼平苷粗品溶解配制成 1%溶液，上大孔树脂柱吸附，饱和后用适当浓度乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，低温干燥即得纯化后的京尼平苷产品。1.3.4 京尼平苷标准曲线的制作与产品纯度检测分别取京尼平苷标准溶液（0.132 mgml1）0.1，0.2，0.5，1.0，1.5 ，2.0 ，3.0，4.0 ml 于 10 ml 量瓶中，每瓶补水至 4 ml，分别加入 1.0 ml 乙酸缓冲液(pH=5.0)，混匀后再加入 1.0 ml 葡萄糖苷酶溶液，50水浴水解 2 h， 然后再加入1.0 ml 2%精氨酸溶液，80水浴中反应 1 h，定容至 10 ml 量瓶中，然后在 590 nm 波长下测定吸光值，即得标准曲线。 6取一定量产品配成一定浓度溶液，取该溶液 2 ml 再加 2 ml葡萄糖苷酶溶液，50水浴水解 2 h，然后取 2 ml 水解液加 2 ml精氨酸溶液，80显色反应 1h，然后在 590 nm 处测吸光值 A，对照标准曲线得其纯度。2 结果与讨论2.1 活性炭与大孔树脂吸附京尼平苷的性状分别取处理好的活性炭与大孔树脂 5 g，加入到已测 A238 nm 的 20 ml 栀子黄废液中，振荡吸附 12 h，抽滤，测滤液 A238 nm 。结果见表 1。表1 不同吸附剂对京尼平苷的吸附情况（略）从表 1 可以看出活性炭和 HPD100 对京尼平苷的吸附量较大，所以选用活性炭和 HPD100 作为纯化京尼平苷的吸附剂。2.2 活性炭吸附分离京尼平苷按步骤 1.3.2.1 预处理 50 g 活性炭，加入 500 ml 栀子黄废液中，室温搅拌吸附 5 h。吸附前A238=5000.567，吸附后 A238=200.284,吸附后抽滤得活性炭，用去离子水冲洗，再用 10%乙醇溶液冲洗,再用无水乙醇洗脱，抽滤，得滤液，低温干燥后得粗产品 3.31 g。2.3 HPD100 纯化京尼平苷72.3.1 吸附条件的选择2.3.1.1 温度对吸附的影响研究了不同温度下，树脂的吸附情况。分别取 20 ml 浓度为 1%的粗产品溶液，在20，30，40，50震荡吸附 12 h，测其吸附率。结果见图 1。由图 1 可知，温度对吸附率的影响不是很大。因此，选在室温（25）下吸附。2.3.1.2 流速对吸附的影响上柱流速是影响树脂吸附的一个重要因素。考察了不同流速对树脂的吸附率的影响。结果见图 2。由图 2 可知，当流速为 3 ml/min 时，树脂吸附率最大。因此选用3ml/min 为吸附最佳流速。2.3.2 洗脱条件的选择2.3.2.1 洗脱剂的选择考察了不同洗脱剂的洗脱效果。取适量吸附后的树脂，分别加入不同的洗脱剂洗脱。然后测洗脱液 238 nm 处的吸光度值。结果见表 2。由表 2 可知， 70乙醇溶液洗脱率最大，因此选用 70乙醇溶液作为洗脱剂。表 2 不同洗脱剂的洗脱效果洗脱剂（略）2.3.2.2 流速对洗脱的影响流速是影响洗脱效果的重要因素，8本文研究了不同流速对洗脱的影响。结果见图 3。由图 3 可知当洗脱流速为 5 ml/min 时，达到最佳洗脱效果，因此选用 5ml/min 为洗脱流速。 2.3.3 HPD100 吸附纯化京尼平苷取京尼平苷粗品 2 g，溶解后稀释成 1%溶液。按 1.3.3.1 预处理 HPD100 树脂 50 g，装柱，然后将粗产品溶液以 3 ml/min 上 HPD100 柱，饱和后用去离子水洗。再用 70%乙醇溶液以 5 ml/min 洗脱，收集洗脱液，低温干燥得京尼平苷产品 0.876 g。2.4 标准曲线的制作按方法 1.3.4 作标准曲线。结果见图 4。从图 4 可知，京尼平苷浓度在 1.352.8 gml1范围内呈线性关系，其线性回归方程为 Y= 0.240 9 X + 0.003 6，相关系数 r=0.999 8，溶液吸收系数为 1.86104 mlg1cm1。最低检测限为 0.66 gml1。2.5 产品纯度的检测粗产品纯度的检测：取一定量粗产品配成 0.1%溶液，取 2 ml 再加 2 ml 葡萄糖苷酶溶液，50 水浴水解 2 h，然后再取 2 ml 水解液加 2 ml 精氨酸，80 显色反应 1 h，然后在 590 nm 处测吸光值 A=0.805，对照标准曲线得其纯度9为 17.56%。京尼平苷成品纯度的检测：取一定量京尼平苷成品配成 0.02%溶液，取 2 ml 再加 2 ml 葡萄糖苷酶溶液，50水浴水解 2 h，然后再取 1ml 水解液加 2 ml 精氨酸，80显色反应 1 h，然后在590 nm 处测吸光值 A=0.359，对照标准曲线得其纯度为58.42%。3 结论研究了京尼平苷提纯的工艺，采用两步吸附分离法，即先采用活性炭从栀子黄废液中吸附分离京尼平苷，然后再将粗产品溶液以 3 ml/min 上 HPD100 柱，吸附饱和用 70%乙醇溶液以 5 ml/min 洗脱，收集洗脱液，低温干燥即得京尼平苷成品，纯度达58.42%。该项工艺操作简单，为工业化生产京尼平苷奠定了基础。参考文献：1彭婕，钱之玉，刘同征，等. 京尼平苷和西红花酸保肝利胆作用的比较J.中国新药杂志，2003，12(2)：105.2张伯熙，单永年，李国霞，等.京尼平苷对大豆产量的影响J.上海蔬菜，1999，(1):33.103Chen L, Ma L L, Park N H. Cariogenic actinomyces identified with a Glucosidase-dependent green color reaction to gardenia jasminoides extractJ.MicroBiology，2001，39(8)： 3009.4黄治本，顾其胜. 新型交联剂京尼平在生物医学中的应用与发展J.上海生物医学工程，2003，24(1): 21.5刘成伦，徐龙君. 从栀子黄废液中分离京尼平苷J.渝州大学学报(自然科学版) ，1995，12(3)：51.6Lee S W, Lim J M, Bhoo S H. Colorimetric determination of amino aci