D M T l 的高表达在M E S 2 3 5 细胞铁聚积中的作用及人参皂苷R g l 的保护作用机制研究摘要帕金森病( P a r k i n s o n sd i s e a s e ，P D ) 是一种以黑质多巴胺( d o p a m i n e , D A ) 能神经元变性坏死为主要病理特征的中枢神经系统退行性疾病，病因尚未阐明。足够的证据证实铁在帕金森病中是一个关键因素。但铁在黑质的选择性聚积的原因至今还不是十分清楚。新的铁转运蛋白的发现是铁代谢领域的重大突破，为解释这一问题提供了理论依据。二价金属离子转运蛋白1 ( d i v a l e n tm e t a lt r a n s p o r t1 ，D M T l ) ，也被称为具天然抗性的巨噬细胞蛋白2 ( n a t u r er e s i s t a n c e a s s o c i a t e dm a c r o p h a g e p r o t e i n2 ，N r a m p 2 ) ，是哺乳类的第一个跨膜铁转运蛋白。研究发现D M T l 参与脑铁代谢，并且发现在P D 病人脑黑质D M T l 表达异常增高，这与P D 病人脑内铁的异常沉积恰巧是同一 个部位。本室前期研究亦表明在1 一甲基4 苯基一1 ，2 ，3 ，6 _ 四氢吡啶( 1 - m e t h y l 4 一p h e n y l l ，2 ，3 ，6 一t e t r a h y d r o p y r i d i n e ，M P T P ) $ 1 J 备的P D 模型小鼠上，观察到黑质内铁选择性堆积和D M T l 的表达增加，提示D M T l 的高表达可能参与了铁聚积。本实验为了验证D M T l 的表达增加可以导致铁聚积，选用M E S 2 3 5 多巴胺能神经细胞系作为神经元的模型，应用分子生物学，免疫荧光，激光共聚焦显微镜，流式细胞仪，H P L C 等方法研究了D M T l 的高表达在细胞铁聚积中的作用。D M T l 的高表达为P D 的防治提供了新的药物作用靶点。人参皂苷R g l 是近年来研究较多的一种人参单体，药理研究表明它具有抗神经细胞凋亡、抗衰老、抗氧化、提高免疫力、类雌激素等作用。为探讨R g l 对6 羟基多巴胺( 6 - h y d r o x y d o p a m i n e ，6 O H D A ) 处理的M E S 2 3 5 细胞铁代谢的影响，本实验应用荧光染料c a l c e i n 结合激光共聚焦显微镜，逆转录聚合酶链式反应( r e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，R T - P C R ) ，W e s t e r nb l o t s 等方法检测了R g l 对细胞内铁水平和D M T l 表达的影响，并进一步研究其可能机制。结果发现：一D M T l 的高表达在M E S 2 3 5 细胞铁聚积中的作用1 免疫荧光检测结果显示D M T I + I R E 和D M T l I R E 在体外培养的M E S 2 3 5 细胞上均有表达。2 应用R T - P C R 的方法从人胚近段小肠中获取人的全长D M T Ie D N A ，包括+ I R E 型和I R E 型，测序结果正确。利用细菌内同源重组法成功构建了携带D M T l 编码基因的重组腺病毒载体。经P a c I 酶切鉴定和P C R 鉴定获到重组腺病毒载体p A d E a s y l D M T I + I R E 和p A d E a s y l - D M T l 一I R E 。重组腺病毒质粒转染2 9 3 细胞成功制备了高滴度的重组腺病毒。3 重组腺病毒A d D M T I + I R E 或A d D M T l I R E 分别感染M E S 2 3 5 多巴胺能神经细胞系，2 4h 后可观察到绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，G F P ) 的表达。W e s t e r nb l o t s 检测到A d D M T I + I R E 感染的细胞D M T I + I R E 的蛋白水平较病毒对照组有明显的增加；A d D M T l I R E 感染的细胞D M T l I R E 的蛋白水平较病毒对照组有明显升高( P 4k b 用此步)( 5 ) 将纯化柱置于2m l 收集管上，静置2m i n 后1 3 0 0 0 r m i n 离- 1 二, 6 0S e C 。( 6 ) 弃去收集管中液体，于纯化柱中加入O 7 5m lP E 缓冲液，加无水乙醇至满，1 3 0 0 0r m i n 离心3 0 6 0s e c 。弃去收集管中液体，将纯化柱1 3 0 0 0r m i n 继续离心1m i n 。( 7 ) 将纯化柱置一新收集管上，在纯化柱中央加入5 0g l E B 缓冲液，静置lm i n 。1 3 0 0 0r m i n 离心1m i n ，洗脱D N A 片段( 离心管内即为纯化的D N A 片段) ，2 0 。C 保青岛大学博，十：学何论文存备用。2 1 8 目的基因的序列测定T A 克隆将P C R 扩增产物与高效克隆载体p M D I8 Ts i m p l e 进行连接，连接产物转化至E c o l iD H 5 a 感受态细菌中，进行T A 克隆( 按照试剂盒说明书进行操作) ，在含有X g a l 幂I I I P T G 的氨卞青霉素L B 平板卜进行蓝白斑选择。T A 克隆的鉴定挑取单个白色菌落，碱裂解法提取质粒D N A ，以质粒D N A 为模板进行P C R 扩增，同时用限制性内切酶K p nI 齐l l H i n dI I I 对质粒D N A 进行双酶切，P C R扩增J 拉物和酶切产物于含溴化乙锭( O 5I x g m L ) 的1 2 琼脂糖凝胶中电泳进行检测，紫外透射仪下观察电泳结果。序列测定将T A 阳性克隆送往 ：海生工生物一I ：程技术有限公司进行D N A 序列测定，测序结果与G e n e B a n k 中D M T l 标准编码基因序列进行比对。2 2 携带D M T l 基因的腺病毒载体的构建2 2 1 质粒、菌株和包装细胞系携带G F P 报告基凶的腺病毒穿梭质粒p A d T r a c k C M V ，E 1 区和E 3 区缺失的复制缺陷5 型腺病毒骨架质粒p A d e a s y 一1 ，大肠杆菌B J 5 1 8 3 ，J M l 0 9 矛L I D H l 0 B 由本室保存。质粒p A d T r a c k C M V 含有C M V 启动子、G F P 报告基因、卡那霉素K a n 抗性标志、P a cI 酶切位点、P m eI 酶切位点。p A d T r a c k C M V 质粒图谱一飞L I T R1 。鬣c 。魏V2 3 5 I 黔b a l2 3 5 6I H i n d l l l2 3 _ 凯h o l2 3 6 带H2 3 7 E 腿a I I2 3 8 ：第一章D M T l 的高表达在M E S 2 3 5 细胞铁聚积中的作用研究p A d e a s y - 1 质粒图谱2 2 2 常用试剂限制性内切酶K v nI 和H i n dI I I 、p M D l 8 Ts i m p l e 载体、D N A 转染试剂盒l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 购自I n v i t r o g e n 公司。限制性内切酶P m eI 和P a eI 购I ! I N E B 公司。Q I A q u i c kP C RP u r i f i c a t i o nK i t 购自德m Q I A G E N 公司。D - H a n k s 粉剂系H y c l o n e 公司产品。D M E M 培养液、胎牛血清购自美国G I B C O 公司。胰蛋白酶购自美 S i g m a 公司。饱和酚、氯仿、异丙醇、无水乙醇、氢氧化钠、甲醛、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和枸橼酸钠均为国产试剂。2 2 3 常用试剂配制! 墨墨渣：7 0m l 水中加入胰化蛋白胨( B a c t o - T r y p t o n ) lg ，酵母提取物( Y e a s t - E x t r a c t ) 0 5g ，N a C l0 5g ，聚K , - - 醇( P E G 4 0 0 0 ) 1 0g ，二甲基亚砜( D M S O )5m 1 ，1m o l LM g C l 25m l ，调至P H 6 5 ，加水至1 0 0m l ，0 2 2l x m 滤器过滤，2 0 “ C 保存。 皿：0 1m o l LN a C l ，1 0m m o l L “ I r i s C 1 ( P H 8 0 ) ，1m m o l LE D T A ( P H 8 O ) 。S O LI ：5 0m m o l L 葡萄糖，2 5m m o l LT r i s C 1 ( P H 8 O ) ，1 0m m o l LE D T A ( P H 8 0 ) 。塾必! - ( 使用时新鲜配制) ：1 S D S ( 贮存液1 0 S D S ) ，0 2m o l LN a O H ( 贮存液5m o l LN a O H ) 。S O L I I I ：5m o l L 乙酸钾6 0m 1 ，冰乙酸1 1 5m l ，H 2 02 8 5m l 。卫( P H 8 O ) ：1 0m m o l LT r i s C 1 ( P H 8 O ) ，1m m o l LE D T A ( P H 8 0 ) 。1 3青岛大学博十学位论文L 旦培差基：1 0g L N a C l ，1 0g L 蛋白胨，5g L 酵母提取物，1 5g L 琼脂( 用于铺平板) ，用N a O H ( 2m o F L ) 调p H 至7 0 ，高压灭菌。氢茔壹重塞：用纯水配制5 0m g m L 贮存液，过滤除菌，2 0 “ C 保存备用，使用浓度1 0 0P g m L 。卡那霉素：用纯水配制5 0m g m L 贮存液，过滤除菌，2 0 “ C 保存备用，使用浓度3 5p g m L 。链霉素：用纯水配$ U 5 0m g m L 贮存液，过滤除菌，2 0 “ C 保存备用，使用浓度3 5p g m L 。l Q 兰旦墨缓泣液：1 4 4gN a 2 H P 0 4 ，8gN a C l ，0 2gK C I ，o 2 4gK H 2 P 0 4 溶于8 0 0m ld d H 2 0 中，用H C l 调p H 值至7 4 ，定容到1L ，1 0 3 4 x 1 0 5P a 灭菌2 0m i n 。鏖蛋自醛：用D - H a n k s 液配成0 1 的溶液，过滤除菌，一2 0 “ C 保存。2 2 4 常用仪器二氧化碳培养箱( 美国T h e r m oe l e c t r o n 公司) 。倒置显微镜( 日本O l y m p u s 公司) 。超声粉碎仪( B r a n s o n 公司) 。颗粒制冰机( 日本S a n y o 公司) 。普通台式离心机T G L 1 6 C 型、恒温水浴锅、微波炉、超净工作台、S H Z C 恒温振荡培养箱和照相装置等均为国产仪器。2 2 5 目的基因与载体双酶切测序结果显示D