中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名： 5 1 0 n m 由S I T S 像机收集( D a g e l n s t r u m e n t ) 。F u r a - 2 减少的百分比在加入1 0 0 1 z MA T P 一分钟后进行分析。悬液中星形胶质细胞体积用C o u l t e r 记数仪计算( M u l t i s i z e r ，C o u l t e r 电子公司) ，星形胶质细胞经分解并在无血清D M E M F 1 2 培养液中恢复- I , H , - t 后测量。光圈管的直径为l O O I x m ，细胞体积用9 8 9 斗m 直径球做表准化。实验结果为了检验钙信号与星形胶质细胞体积增加相联系这一假设，本实验采用三种不同的方法测量了细胞体积的相对变化。首先应用共聚焦X - Z 激光扫描技术( S c h r e i b e re ta 1 ，1 9 9 9 ) C a l c e i n A M ( 5 1 x M ) 孵育3 0 分钟后用4 8 8 n m 激发进行x - z 方向横切面扫描( F i g 1 ) ，测量了腺苷受体刺激前后- 9 细胞体积。采用这种方法的原因是有大量实验报道显示星形胶质细胞内钙信号是由A T P 调节的( C o t r i n ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。加入 0 0 F 。MA T P 导致显著横切面体积增加，而此体积的变化可被细胞内钙的鳌合剂B A F F A A M( 2 0 p 。M ) 所降低。第二种方法系采用荧光稀释的方法( H a n s o ne t8 1 ，1 9 9 4 )探测到F u r a 一2 孵育后并加入A T P 的星形胶质细胞有9 6 士1 3 荧光降低，与之相比对照组有1 1 1 3 荧光增加( P 0 0 1 ) 。第三种方法系悬浮 的培养的星形胶质细胞液中加入A T P 后用C o u r i e r 计数仪检测细胞体积( R a u te ta 1 ，1 9 9 6 ) 。结果显示有意义的可反转的细胞体积增加，其平均值在第3 0 秒时为3 5 0 6 ( P 4 7m M 蔗糖) 完全阻断谷氨酸释放。谷氮酸释放与渗透质变化的回归曲线关系为：Y = 一0 1 8 1 X + 2 6 5 6 R 2 = 0 9 9 4 。此测量为渗透性增加1 5 时的值。霹襄 啦。嚣O1 8 F i g 3星形胶质细胞c a “信号与有机渗透电解质的联合释放相关联( A ) 细胞外谷氨酸水平变化的时程关系。图示为1 0 0 肛MA T P 触发2 5 倍谷氨酸释放的增加，而低渗 2 1 4 m O s U l ) 可诱发谷氮酸1 0 倍的增加。高压液相色谱( H P L C ) 分析表明，A T P 诱导了谷氨酸，天冬氨酸，谷胺和牛磺酸的释放，但不包括天冬酰胺，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸和络氨酸。低渗变化引发氨基酸大量释放，其释放氨基酸的种类与A T P 相似。氨基酸释放的量以基础释放量的分数表示。( B ) B A P T A 与N P P B 不仅抑制了A T P 诱导的谷氨酸释放，而且抑制谷胺和牛磺酸的释放。Ab 鬟 卷雩，oO。1 B A l 3 T AF i g 4P G E ：激发了培养的星形胶质细胞的谷氨酸释放- 1 9 -( A ) P G E ：( 1 0 0 肛M ) 诱导星形胶质细胞体积膨胀，该膨胀可被B A P T A A M ( 2 0 I x M ，lh r ) 所抑制。星形胶质细胞体积由共聚焦x z 线扫描来显示。( B ) P G E ：诱导星形胶质细胞谷氨酸释放与A T P 之比较。谷氨酸释放可被B A P T A以及阴离子通道阻断剂N P P B ( 1 0 0 1 - M ) 所抑制。P 一2 0 0 p A ，当输入阻抗波动大于2 0 时则弃之不用。记录信号经八级B a s s e l 低通虑波，高通虑波为2 K H z 。记录软件为P c l a m p8 2 ( A x o nI n s t r u m e n t sl n c ) ，采样周期为5 0 1 , S 。所采集到的数据用O r i g i n5 1 和C o r e l D r a w9 0分析处理。相对离子通透性为：G l u 一K + ( P c I 。P K ) ，G l u 一N a + ( P G l 。P N 。) ，G l u ”C 1 一( P G 】。P c l ) a n dG ! u C s + ( P G l 。P c ；) ，采用G o l d m a n H o d g k i n K a t z 公式计算：。R T ，fP “K ，。+ P N 。 N a j 。+ P 。l c 1 0 u I + P 。 G o u t + P c 。 C s i 。1匕2 了I nI 瓦犀丁= i 习瓦丁= = ：i 蕊西( 再雨再了瓦K 五JP 1 。采用反转电位进行计算，见F i g 6 D b 相应于P G l 。P c 。，P G J P H 。a n dP c J P c l 由F i g7 D a ，f r o mF i g7 D ca n dP c l 。P c 。，a n df r o mF i g 7 D da n dP 。P 。，分别得到。远距点电刺激2 s e e ，1 0 0 H z ，1 , 0 0 u A 电脉冲) ，由双极电极置于脑片的表面( S c h i p k ee ta 1 ，2 0 0 2 ) ，I q X ( 1 汕M ) 施加于细胞外液中。实验结果J c a “调节的谷氨酸通透性通道的开放为了检验谷氨酸通透的阴离子通道的激活与细胞内c a 2 + 增加的关系，本实验测量了培养的星形胶质细胞在嘌呤刺激下全细胞离子电流。为去除阳离子内向电导的影响，在细胞外液中用N M D G 替代N a + 离子，同时细胞内液用1 0 0 m MC s + G l u c o n a t e 2 3 m MC s + G l u t a m a t e ( C 1 f r e e ) 。在此记录条件下，谷氨酸是唯一可通透的阴离子。A T P ( 1 0 0 p M ) 触发一内向电流( 1 5 c e l l s 4 1 c e l l s ) 。其平均电流幅度为1 3 8 3 6 p A ( 范围在：2 5 2 9 0 p A ，F i g 5 A a ) 。这一结果提示：嘌呤性c a 2 + 信号与可通透谷氨酸通道的开放有 关。当用N a C l 替代N M D G 时所记录到的电流幅度为2 5 0 3 3 p A ( 范围在：7 0 6 7 0 p A ) ( F i g 5 A b ) 。这表明了此通道亦对N a + 有通透性。本实验还检验了K + 离子在这一通道的通透性。当记录电极中含有K G l u e o n a t e ( 不舍G l u t a m a t e ) ，在细胞外液中N M D G 替代N a + 时，没有记录到2 5 -内向电流，相反记录到- I , 的外向电流( F i g 5 A c ) ，提示此通道对K + 亦有 通透。该A T P 诱导的电流可被l O m MB A P T A 阻断( F i g 5 A d ) 。这一现象与所观察到的B A P T A 可减小培养星形胶质细胞谷氨酸释放相一致( F i g 2 B ) 。1 0 0 斗MN P P B 明显地降低A T P 诱发电流的频率与幅度( 3 c e U s 3 0 c e l l s ) ( F i g 5 A e ) 。综合上述实验结果明显地表明A T P 激活的谷氨酸通透的通道是C a 2 +依赖性的并可被N P P B 所抑制。去除细胞外液中的c a “( 在N M D G 存在的壮态下) 呈现不显著的A T P 诱发电流幅度的降低。而用I 一替代C l 一( N a l )减弱该内向电流( F i g ，5 A ) 。此结果与观察到的I 一可明显地以抑制培养的星形胶质细胞体积的恢复相一致( P a r k e r s o na n dS o n t h e i m e r ，2 0 0 3 ) 。当用1 5 蔗糖增加细胞外液的渗透压可减弱A T P 诱导的细胞膨胀并降低A T P诱发电流幅度( F i g 5 A ) 。将细胞与P 2 X 7 受体抑制剂Q x A 。F P ( 3 0 0 1 x M ，l 小时) 孵育，并未明显 影响A T P 诱导电流幅度及发生几率，提示P 2 X 7 在c a 2 + 依赖性的垦形胶质细胞谷氨酸释放过程中并不具有显著意义( F i g 5 A ) 。 2 A T P 激活通道离子通透性的研究为了进一步探讨培养的星形胶质细胞A T P 诱导电流的离子通透特性，本实验测量了在不同离子状态下反转电位。首先在给与A T P 前后施加斜波指令电压。净I V 曲线电流为使用A T P 前后的差值( F i g 。5 B ，s i g h t ，I A T P ) 。此方法在于去除漏电流。在电极内液中用1 0 0 m MC s G l u t a m a t e 2 3 m MC sG l u c o n a t e ，细胞外液为N M D G 时，A T P 诱导电流的反转电位为1 8 1 6 8 m V ( F i g 5 B a ) 。在用K + 替代c s + 时反转电位左移到一2 1 3 5 3 m V ( F i g 5 B b ) ，提示该通道对K + 有通透性。当用N a + G l u c o n a t e 替代细胞外液中N M D G ，同时电极内液为l O O m MC s + G l u t a m a t e 2 3 m MC s + G l u c o n a l e ，1 3 0 r a MN a + G l u c o n a t e 在细胞外液中，此时时反转电位右移到5 5 6 7 m V ( 1 q g 5 B c ) ，表明该通道对N a + 有通透性。最后本实验用氯化胆碱( C 1 1 0 l i n e c h l o r i d e ) 替代N M D G ( 1 0 0 m MC s G l u t a m a t e 2 3m MC s + G l u c o n a t e 在电极内液中，1 2 6 m MC h o l i n eC h l o r i d e 在细胞外液) ，反转电位左移到一1 8 04 - 7 7 m V ( F i g 5 B d ) 。由本实验的结果表明A T P 激活通道具有广泛的离子通透性，因而采用G o l d m a n H o d g k i n K a t z 公式计算了各自的相对通透性( F i g 5 B ) 。P G l u P k= 0 5 ，P G l u P C s = 2 5 ，P G l u P N a = 0 4 ，P G l u P C I = 1 0 。鉴于细胞内的2 6 K + 很难完全被C s + 所替换，因而P G l u P C s 的实际值可能大于2