人抗中性粒细胞胞浆抗体（cANCA） IgM 酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用最低检测限：1 ng/ml特异性：本试剂盒可同时检测人 cANCA （IgM），且与其他相关抗体无交叉反应。有效期：6 个月预期应用：ELISA 法半定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中 cANCA （IgM）含量 。说明1试剂盒保存：-20（较长时间不用时）；2-8（频繁使用时）。2浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。3中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。4刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。实验原理用中性粒细胞胞浆包被酶标板，制成固相载体。向微孔中先加入待测样品进行反应，然后再加入辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 进行反应，经过彻底洗涤后用底物 TMB 显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 cANCA （IgM）呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品中抗体的效价（抗血清最终能显色的最高稀释倍数记为效价）。试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板（Assay plate ）：一块（96 孔）。2. 样品稀释液（Sample Diluent）：120ml/瓶。3. 辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 稀释液 （HRP-anti-human IgM Diluent）：110ml/瓶。4. 辣根过氧化物酶标记抗人 IgM（HRP-anti-human IgM）：1120l/瓶（1：100）。5. 底物溶液（TMB Substrate）：110ml/瓶。6. 浓洗涤液（Wash Buffer）：120ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍。7. 终止液（Stop Solution）：110ml/瓶（2N H2SO4）。需要而未提供的试剂和器材1. 标准规格酶标仪2. 高速离心机3. 电热恒温培养箱4. 干净的试管和 Eppendof 管5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器6. 蒸馏水，容量瓶等标本的采集及保存1. 血清：全血标本请于室温放置 2 小时或室温过夜后于 1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。2. 血浆：可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后 30 分钟内于 2 - 8 C 1000 x g 离心 15分钟，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。3. 细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g 离心 20 分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20或-80保存，但应避免反复冻融。注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。标本的稀释原则：首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算抗体效价时，稀释了“N”倍，标本中抗体的效价为“N”。辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 的稀释原则：临用前以辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔 100l），实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。如10l 辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 加 990l 辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。操作步骤实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡 。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。1. 加样：分别设空白孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100l，余孔加待测样品 100l，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37反应 120 分钟。2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 工作液 100l（取 1l生物素标记抗体加 99l 生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37，60 分钟。3. 温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分钟，350l/每孔，甩干 。4. 依序每孔加底物溶液 90l，37避光显色（30 分钟内，此时肉眼可见孔内有明显蓝色，即可终止）。5. 依序每孔加终止溶液 50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。6. 用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后 15 分钟以内进行检测。注：1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。2. 每次实验留一孔作为空白调零孔， 该孔不加任何试剂， 只是最后加底物溶液及 2N H2SO4。测量时先用此孔调 OD 值至零。3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于 2-8保存。辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的辣根过氧化物酶标记抗人 IgM 工作液。5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸 ，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少 0.3ml 注入孔内，浸泡 1-2 分钟。根据需要，重复此过程数次。自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。计算为检测样品中 cANCA （IgM）效价，客户可以采取样品 2 倍倍比稀释样品计算抗体效价，一般采取以 1:40 为起始稀释倍数（使用样品稀释液进行稀释）。最大稀释倍数根据客户自身试验要求而定，最终显色与阴性对照孔进行比较，有明显差异的最大稀释度定为抗体的最终效价。注意事项1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。3. 一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。5. 在配制检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。6. 底物请避光保存。7. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。