Y ，8 1 8 6 09分类号U DC密级编号第一军医大学硕士学位论文人高迁移率族蛋白1 的克隆、表达及其功能研究C l o n i n g ，e x p r e s s i o na n df u n c t i o n a ls t u d yo ft h eh u m a nh i g hm o b i l i t yg r o u pb o x1p r o t e i n赵雷指导教师姓名姜勇主任、教授、博士单位名称及地址第一军医大学广州同和( 5 1 0 5 1 5 )专业名称病理生理学论文提交日期2 0 0 5 年5 月论丈答辩日期2 0 0 5 年6 月1 2 同学位授予单位和日期第一军医大学2 0 0 5 年6 月答辩委员会主席赵克森教授论丈评阔人徐军教授、熊静波副教授2 0 0 5 年5 月2 8 | _ 硕士学位论文A m pA = r Pb p D N AF B SG C S FG M C S FnH M G B lH R PH U V E Cl C A M 1I F N vI LI P T Gk bL BL P SM C P 1M F IM I Pm l nM O D SN H C PO DP A G EP B SP C R英文缩略词表( A B B R E V L 钢【1 0 N S )A m p i c i l l i na d e n o s i n et r i p h o s p h a t eb a s ep a i rd e o x y r i b o n u c l e i ca c i df e t a lb o v i n es e r u mg r a n u l o c y t ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o rg r a n u l o c y t e m a c r o p h a g ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o rh o u rh i g l lm o b i l i t yg r o u pb o xlp r o t e i nh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s eh u m a nu m b i l i cv e i ne n d o t h e l i a le e l li n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l e - 1i n t e r f e r o n Yi n t e r l e u k i ni s o p r o p y l B D t h i o g a l a c t o s i d ek i l o b a s e sL u r i a B e r t a n im e d i u ml i p o p o l y s a c c h a r i d em a c r o p h a g ec h e m o t a c t i cp r o t e i n 一1m e a nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ym o n o c y t ei n f l a m m a t o r yp r o t e i nm i n u t em u l t i p l eo r g a nd y s f u n c t i o ns y n d r o m en o n h i s t o n ec h r o m a t i np r o t e i no p t i c a ld e n s i t yp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i sp h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n氨苄青霉素三磷酸腺苷碱基对脱氧核糖核酸胎牛血清粒细胞集落刺激因子粒一巨噬细胞集落刺激因子小时高迁移率族蛋白1辣根过氧化物酶人脐静脉内皮细胞细胞间黏附因子1干扰素Y白细胞介素异丙基一B D 一硫代半乳糖千碱基L B 培养基脂多糖单核细胞趋化蛋白1平均荧光强度巨噬细胞炎性蛋白分多器官功能障碍综合征非组蛋白染色体蛋白质光密度聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液聚合酶链反应英文缩略词表R A G Er e c e p t o rf o r a d v a n c e dg l y c a t e de n d晚期糖基化终产物受体p r o d u c t sr p mSS D SS I R ST L RT N F aV C A M 1r o t a t i o np e rm i n u t es e c o n ds o d i u md o d e c y ls u l p h a t es y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e s p o n s es y n d r o m et o l l l i k er e c e p t o rt u m o rn e c r o s i sf a c t o r - av a s c u l a rc e l la d h e s i o nm o l e c u l e 一1每分钟转速秒十二烷基磺酸钠全身炎症反应综合征T o l l 样受体肿瘤坏死因子a血管细胞黏附分子1硕士学位论文人高迁移率族蛋白1 的克隆、表达及其功能研究硕士研究生：赵雷导师：姜勇教授摘要研究的目的和意义脓毒症( s e p s i s ) 指由感染引起的全身炎症反应综合征( s y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e s p o n s es y n d r o m e 。s m s ) ，是各种严重创伤、烧伤、缺氧、再灌注损伤及外科大手术后常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征( m u l t i p l eo r g a nd y s f u n c t i o ns y n d r o m e ，M O D S ) ，是当前创伤外科面临的棘手难题，已成为临床危重患者的重要死因之一一。近十年来，随着炎症反应机制研究的不断深入，人们对于脓毒症的本质与病理过程有了进一步的理解，即认识到脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克及M O D S 是反映体内一系列病理生理改变及临床病情严重程度变化的动态过程，实质是机体全身炎症反应不断加剧、持续恶化的结果。严重创伤可以诱发初期的炎症反应，但由于机体产生的多种炎症介质所形成的级联效应，可使炎症反应扩大甚至失去控制，最终导致以细胞自身性破坏为特征的全身性炎症反应。过去普遍认为“早期”炎症介质如T N F a和I L 1 是引起多器官损害和死亡的“核心因子”，然而T N F - a 和I L 一1 受体拮抗剂的临床应用并未取得明显效果。脓毒症后期，虽然患者病情持续加重直至死亡，但是T N F a 和I L l 水平往往已恢复至正常。这提示人们，可能存在某些晚期炎症介质参与了脓毒症后期的病理生理过程。1 9 9 9 年，W a n g 等首次报道高迁移率族蛋白1 ( h i g hm o b i l i t yg r o u pb o x 一1中文摘要p r o t e i n ，H M G B 一1 ) 作为新的潜在的晚期炎症介质参与了脓毒症的发病过程，是内毒索致死效应的晚期重要炎症介质。此后，有关H M G B l 与脓毒症的关系同益成为人们关注的热点。越来越多的文献报道，在各种急性炎症条件下，H M G B l可在细胞外或胞浆的表达。在对小鼠内毒素血症的研究中发现，L P S 激发1 6 3 2h 后血清H M G B l 水平显著升高，且给小鼠全身注射r H M G B l 可致死。体外研究发现，H M G B l 能诱导巨噬细胞和中性粒细胞产生炎症介质T N F n 、I L 1 a 、I L - 1 B 、I L 6 、I L - 8 、M I P 1 c t 、M I P 一1 B ；用全长H M G B l 分子或H M G B l 的B 盒片段刺激人脐静脉内皮细胞可上调I C A M 1 、V C A M 1E 选择素等粘附分子，并促进I L - 8 、G C S F 释放，且呈剂量关系。目前，有关H M G B l 作为脓毒症新的“晚期”介质研究尚处于探索阶段，许多重要问题亟待研究。例如，H M G B I 是否确实参与了全身炎症反应的发生、发展过程? H M G 2 1 介导炎症细胞活化的信号转导过程是什么? 其改变与严重剞伤后脓毒症的本质联系及临床意义如何? 针对H M G B l 这一潜在“晚期”介质进行干预是否有助于脓毒症及M O D S 的防治? 这些问题的解决可望为脓毒症和M O D S 的发病机制提供新的理论解释，并为其防治开辟新的途径。基于上述研究背景，本课题拟通过重组H M G B l ，观察其对参与炎症反应的重要细胞内皮细胞释放细胞因子的影响；了解H M G B l 能否协同L P S 刺激内皮细胞释放炎性细胞因子? 为迸一步探讨H M G B l 病理生理作用及其调控机制打下基础。研究方法1 H M G B l 基因的克隆：通过聚合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，P C R )扩增出H M G B l 的编码基因，克隆到载体p E T l 4 b M C S ，通过P C R 、酶切和测序鉴定克隆的J 下确性。2 H M G B l 蛋白的原核表达及纯化：将阳性克隆转化大肠杆菌B L 2 1 ( D E 3 ) ，I P T G 诱导表达H i s H M G B l 融合蛋白，使用N i N T A 亲和树脂纯化。将纯4硕士学位论文化得到的H M G 3 1 蛋白经透析过滤除菌后2 0 。C 保存。3 用不同剂量( 终浓度分别为3p g m l 、1 5 M g m l 、7 5I z g m 1 ) 重组H M G B l刺激H U V E C ，2 4 h 后收集培养上清，经L i q u i C h i p 液相蛋白芯片系统检测G M C S F 、I F N - v 、I L - 1 0 、I L - 1 2 、I L - 1 B 、I L 一2 、I L 一4 、1 L - 6 、I L - 8 、T N F a 、M C P 一1 等1 1 种细胞因子的水平。4 用不同剂量( 终浓度分别为3 , u g m l 、1 5 g m l 、7 5k g m 1 ) 重组H M G B l刺激H U V E C ，2 4 h 后收集培养上清；或在H M G B l ( 1 5 M g m 1 ) 刺激H U V E C后不同时间点收集培养上清，经L i q u i C h i p 液相蛋白芯片系统检测细胞因子I L - 6 、I L - 8 以及M C P 一1 的水平。5 用不同剂量( 终浓度分别为3 # g m l 、1 5 z g m l 、7 5 t g m 1 ) 重组H M G B l与L P S ( 1 0n g m 1 ) 共刺激H U V E C ，2 4h 后收集培养上清，经L i q u i C h i p液相蛋白芯片系统检测细胞因子I L - 6 、l L 8 以及M C P 1 的水平。结果1 克隆的H i s - t a g g e dH M G B l 表达载体经酶切和测序验证正确，并用N i N T A亲和层析法纯化碍到了H i s H M G B l 融合