独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密 ，在_年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在以上方框内打“” ）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华中科技大学博士学位论文第一部分2 型糖尿病患者循环内皮祖细胞数目和功能的变化Part 1The number and function of circulating endothelial progenitorcell in the patients with type 2 diabetes1华中科技大学博士学位论文摘要目的 研究不同时期 2 型糖尿病（T2DM）患者循环内皮祖细胞（EPC）的数目和功能变化以及与血管内皮功能的关系。方法 选择 498 例 2007 年 5 月至 2008 年 4 月就诊的 T2DM 患者及我院体检人群。心脑血管并发症诊断根据明确的心脑血管事件和客观的实验室检查资料。所有患者均做血管超声检查外周血管并发症；免散瞳眼底拍照检查糖尿病视网膜病变；6 个月内连续两次 24h 尿白蛋白检查糖尿病肾病；肌电图检查糖尿病周围神经病变。采用流式细胞仪检测循环 EPC 的数目；体外培养计数集落形成和迁移能力评估 EPC 的功能。采用血流介导的肱动脉血管舒张功能（FMD）评估血管内皮功能。结果 其中正常对照组（NC 组）83 例，T2DM 无血管并发症组（TC 组）97 例，T2DM合并大血管并发症组（TA 组）106 例，T2DM 合并微血管并发症组（TI 组）100 例，T2DM 合并大血管及微血管并发症组（TAI 组）112 例。五组循环 EPC 数目和集落形成能力按顺序排列均为 TA30mg/24h诊断为糖尿病肾病。肌电图检查糖尿病周围神经病变。498 例入选对象根据有无糖尿病以及血管并发症情况分为五组：正常对照组（NC组，n=83），T2DM 无血管并发症组（TC 组，n=97），T2DM 合并大血管并发症组（TA组，n=106），T2DM 合并微血管并发症组（TI 组，n=100），T2DM 合并大血管及微血管并发症组（TAI 组，n=112）。2.2 流式细胞仪检测循环 EPC 的数目（1）密度梯度离心从外周血分离单个核细胞在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。取肝素抗凝静脉血 5ml 与等量 PBS 液充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。18-25水平离心2000rpm20 分钟。离心后管内分为三层，上层为血浆和 PBS 液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带。用枪头插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入 5 倍以上体积的 PBS 液，1500rpm10 分钟，洗涤细胞两次。末次离心后，弃上清，加入PBS 液定容至 200l，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴 0.2台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。8。将从外周华中科技大学博士学位论文（2）流式细胞仪检测 EPC 数目循环 EPC 根据表面标记为 CD45low/CD34+/VEGFR2+的细胞来确定2，7血分离单个核细胞以 10l PerCP、FITC、R-PE 标记的 CD45 抗体、CD34 抗体、VEGFR2抗体 4避光孵育 20 分钟，然后红细胞裂解液孵育 15 分钟，加入 1ml 的 PBS 震荡混匀，1000rpm5 分钟离心，去上清，加入 200lPBS 制成悬液上机。细胞以同型的IgG1-FITC 或 R-PE 染色作为阴性对照。在 R1 门（淋巴细胞）内，设置 R2 门（CD45low的细胞），在 R2 门内 CD34 与 VEGFR2 表达双阳性为 EPC 细胞。每位受试者抽取外周血 2ml 用于淋巴细胞的绝对计数。在全血淋巴细胞计数的基础上，计算每毫升全血中循环 EPC 的数目。2.3 循环 EPC 的分离培养（每组随机选择 12 例）另取空腹外周静脉血 15ml，密度梯度离心法分离单个核细胞，在包被有人纤维连接蛋白（HFN）的 6 孔培养板上的每孔接种 1107 个细胞，在 M199 培养基中（含10 %胎牛血清、VEGF 10g/L、bFGF 2g/L）培养（37，5%CO2）。48 小时后更换培养液，收集非黏附细胞种入 24 孔板中（每孔 1106 个），以后每 2-3 天更换培养液1 次。连续观察体外培养的 EPC 形态及生长情况。2.4 EPC 集落计数（CFU）外周血 EPC 于 5 天左右形成集落，约 78 天时集落内细胞密集。在倒置相差光学显微镜下观察，中央集聚大量的圆型细胞且被外周扁平长梭状细胞呈放射状包绕即为 EPC 的集落。3 位不同研究者分别计数（每个患者计数 4 个孔）。2.5 EPC 的迁移能力用 Boyden 趋化小室（8m 孔径）评估迁移能力。用 0.25胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞，悬浮在 500l 培养液，计数。下层 24 孔中加入 500l 的含有 50 ng/ml 的 VEGF无添加物的培养基，上层加入培养至第 7 天的 EPC（5104 个），37孵育 24 小时。4%多聚甲醛固定 10min 后，苏木素将细胞染成蓝色，计数每个滤膜下层 3 个随机选择的200 视野迁移的 EPC 数目。2.6 血管内皮舒张功能检测每组随机选取 30 例对象进行血管内皮舒张功能检测。采用高分辨超声仪和9（华中科技大学博士学位论文7.0MHz 线阵探头，同步记录心电图。检查时患者仰卧位,右上肢外展 15以肘上 2-5 cm的肱动脉为靶目标。在心室舒张末期(即同步心电图显示 R 波时)测量肱动脉前后内膜之间的距离，每次分别测 3 个心动周期，取其平均值。每位受试者分别测量其休息时（D0）和反应性充血后（D1）后肱动脉内径。休息 15 min，待肱动脉内径恢复至基础状态时, 舌下含服 0.5mg 硝酸甘油（GNT）, 4-5 min 内测量肱动脉最大内径（D2）。在整个测试过程中，超声探头始终处于固定位置，且每次测量肱动脉内径均取同一部位。 D1-D0）/D0 100%和（D2-D0）/D0 100%分别代表血流介导的内皮依赖性血管舒张功能（FMD）和硝酸甘油介导的内皮非依赖性血管舒张功能（GMD）。3统计学分析数据采用均数标准差表示，组间均数比较用 One-Way ANOVA 分析，多元线形回归分析评价不同血管并发症患者循环 EPC 数目和临床资料的关系，Spearman 相关分析评价循环 EPC 数目与 FMD 的关系。非正态分布的定量变量（如 TG、TC）取自然对数后进行分析。采用 SPSS13.0 软件进行统计分析，P0.05 被认为有统计学差异。10华中科技大学博士学位论文结果1. 入选对象临床资料的比较1.1 T2DM患者与正常人群比较TC组、TI组、TA组及TAI四组的空腹（FBG）和平均血糖（HbA1C）较NC组显著升高（P0.05）（表1-1）。1.2 不同时期T2DM患者比较TAI组的HbA1C水平以及糖尿病患病时间显著高于其他三组（P0.05）。TA组SBP和BMI水平显著高于TI组（P0.05）（表1-1）。表 1-1入选对象的一般临床资料（ s）组别NC组例数83性别(男/女)40/43年龄(岁)537患病时间（年）0BMI(kg/)21.832.48SBP(mmHg)120.37.5TC组9748/495163.71.4a24.113.14a137.88.1aTI组TA组TAI组NC组TC组TI组TA组100106112DBP(mmHg)79.36.783.56.482.16.083.76.852/4855/5158/54537526556FBG(mmol/L)5.00.67.81.5a8.21.7a7.91.6a6.32.5ab6.02.7ab10.53.6abcdHbA1C(%)5.20.47.10.6a7.90.9ab7.60.7ab22.212.3824.792.45ac23.152.21TC(mmol/L)4.230.695.141.22a4.481.355.161.18a134.58.4a145.39.4ac139.88.9aTG(mmol/L)1.340.612.360.93a2.250.88a2.281.06aTAI组84.67.3 8.91.9a8.51.0abcd5.031.21a2.130.94a（与 NC 组比较，aP0.05），其余组间两两比较有显著差异（ P0.05）（图 1-1-2）。7 6 55.784.29a432.56ab 1.92abc1.77abc2 1 0 NC组TC组TI组TA组TAI组图1-1-1各组FMD水平的比较（与 NC 组比较，aP0.05），其余组间两两比较有显著差异（P70 岁和0.05）。治疗后FIns和HOMA-IR较治疗前有显著下降（P0.05）；提示二甲双胍能够降低FIns水平、改善胰岛素抵抗。其余临床资料如性别、年龄、血压、TC和HDL-C三组间无明显差异（P0.05）。37（与对照组相比，*P0.05）（图2-5）。65*4.82432102.112.46对照组DM组治疗前DM组治疗后图2-5各组血清MDA水平的比较 4.2 血清总SOD活性如图2-6所示，治疗前T2DM患者血清总SOD活性较正常人群显著降低（31.49 6.12 vs 52.87 5.05U/ml，P99.8%）溶解于三蒸水中配成20mM母液，分装到EP管内-20保存。使用前加入培养基中，对照组培59华中科技大学博士学位论文养基内加入三蒸水。（23） MTT 液的配制：称取 250mg MTT （碧云天生物科技研究所）放入小烧杯中，加 50ml PBS 液（0.01mol/L PH7.4）搅拌 30min，用 0.22m 的微孔滤器过滤除菌，分装，4保存。其余材料同实验第二部分。1.2 入选对象选择 12 例 2008 年 3 月至 2008 年 5 月我院健康体检人群。为避免药物使用的影响，所有对象入组前至少三个月内未服用任何药物（如抗高血压药、调血脂药或雌激素等）。入选标准：没有糖尿病或心血管疾病病史，OGTT 试验糖耐量正常。排除标准：年龄70 岁和0.05）。提示二甲双胍能够改善。结合 2.5 提示二甲双胍能够减少过氧化产物并同时提高细胞的抗氧化能力，有效改善高糖所致的 EPC 氧化应激失衡。605046.98 42#31.34 403020100 对照组图3-6高糖组干预后各组上清SOD活性干预组 68华中科技大学博士学位论文5. 各组 EPC 的 AMPK 磷酸化水平对照组、高糖组、干预组三组细胞内 AMPK 及其磷酸化水平见图 3-7。结果显示在高糖环境下， EPC 的 AMPK 磷酸化水平降低显著，为对照组的 30.57.4%（P0.05）。经过二甲双胍干预后，细胞内 AMPK 磷酸化水平恢复到对照组的 70.69.2%（P0.05）。上述结果提示，二甲双胍能够显著改善高糖导致 EPC内 AMPK 磷酸化水平的下降