华中科技大学硕士学位论文The effect of rosiglitazone on the expression ofthrombospondin-1 in the rat with unileralureteral obstructionPostgraduateInstructorGuo ChengkunProf.Lv YongmanABSTRACTObjetive To investigate the effect of rosiglitazone(RSG) on renal interstitial fibrosisas well as its potential mechanisms in the rat with unilateral ureteral obstruction.Methods rats were randomly divided into sham,UUO and RSG groups. Ratssubjected to UUO were treatded with oral administration of rosiglitazone at 30mg/kg.d orvehicle at the time of 48 hours before the operation until being sacrificed.Groups of 6 ratswere killed at three time points-day3、day7、day14.The percentage of renal tubularlesion,interstitial fibrosis score,the level of nitric oxide,tubulointerstitial thrombospondin-1expression were assessded and compared with UUO and sham groups.Results Rosiglitazone treatment greatly reduced tubular lesion and attenuatedinterstitial fibrosis. The level of nitric oxide in the kidney in groups treated withrosiglitazone were higher than that in UUO groups during the expriment(p0.05).Inaccordance with the level of nitric oxide,the expression of thrombospondin-1 wasdownregulated significantly in the groups treated with rosiglitazone compared with UUOgroups.Conclusions Rosiglitazone supresses tubulointerstitial fibrosis by promoting nitricoxide release in the rat with unilateral ureteral obstruction in the early stage,which is able toinhibit the expression of thrombospondin-1.Key words Rosiglitazone Nitric Oxide Thrombospondin-13，表明促华中科技大学硕士学位论文罗格列酮对梗阻性肾病肾组织血小板反应蛋白 1表达的影响前言肾间质炎症和纤维化是各种慢性肾脏疾病进行性损害的共同病理特征之一，是各种慢性肾脏疾病进展至终末期肾病（ESRD）的共同通路，肾小管间质损害的程度与肾小球滤过率（GFR）呈明显的负相关，而且比肾小球病变更能预测预后（1-3）。因此如何防止肾间质纤维化的形成一直是肾脏病领域研究的热点问题。导致肾间质纤维化的主要原因是肾脏局部胶原纤维的合成代谢超过分解代谢。既往大量研究表明转化生长因子（TGF-）是导致肾脏胶原代谢失衡的主要影响因子，全身组织分泌的 TGF-主要以潜在相关肽-转化生长因子（LAP-TGF）复合物形式存在，而 TGF-在该复合物中无活性，必须经一系列转化被激活才能发挥其生物学功能（34）。研究表明血小板反应蛋白 1（TSP-1）是 LAP-TGF-复合物的主要生理性激活剂，它通过变构效应引起该复合物结构改变从而激活 TGF-（35）。在体内 TSP-1 的表达受一氧化氮（NO）的调节，Wang 研究发现 NO 通过 NO-cGMP-PKG 途径可以减少高糖环境中培养的系膜细胞 TSP-1 的生成，同时减少系膜细胞合成胶原蛋白（8）进肾脏 NO 的释放可能能够防止肾脏纤维化。Polikandriotid 研究发现过氧化物酶体增值激活受体（PPAR-）的天然配体 15d-PGJ2和环格列酮（ciglitazone）及罗格列酮（rosiglitazone)同 PPAR-结合后能够促进脐静脉内皮细胞释放 NO 并提高内皮细胞 NO 的利用率（7）。罗格列酮是人工合成的 PPAR-激动剂，主要用于治疗 2 型糖尿病，最近研究发现罗格列酮除了能够增加组织对胰岛素的敏感性改善胰岛素抵抗，调节血糖和血脂等代谢紊乱作用之外，还具有抗炎，影响细胞增殖和转型以及抗脏器纤维化的作用(4-6)。因此本实验借助单侧输尿管结扎模型（UUO）研究罗格列酮是否通过促进梗阻侧肾脏NO 的释放，下调 TSP-1 的表达，从而减少胶原蛋白的合成，防止肾间质纤维化的形成。4华中科技大学硕士学位论文材料与方法一、材料1、实验动物54 只健康雄性 Wistar 大鼠，体重 180-220g（购自华中科技大同济医学院实验动物中心）。2、实验器材与试剂2.1 实验器材 一次性试管、 EP 管（1ml 0.2ml）、 玻片 、玻片架、 玻片盒、 加样枪、 三角瓶 、冰盒、 匀浆器 、脱水机、 石蜡包埋机、 石蜡切片机、 超低温冰箱、低温离心机、分析天平、PCR 扩增仪、水平电泳仪、恒温水浴箱锅 、UV751GD紫外可见分光光度计 、 HMIAS 系列多功能真彩色病理图像分析系统 、 JS-380 自动凝胶图像分析仪。2.2 主要试剂及配制1）PBS 缓冲液（0.01mM PH7.2） KCL 0.2g、KH2PO40.2g,NaCL 8.0g, Na2HPO4.12H2O1.54g,加双蒸水至 1000mL,10%NaHCO3 调至 PH7.22）枸橼酸盐缓冲液 0.01mM PH6.0A.0.1M 枸橼酸溶液：称取 21.01g 枸橼酸溶于 1000ml 蒸馏水中。B.0.1M 枸橼酸钠溶液：称取 29.41g 枸橼酸钠溶于 1000ml 蒸馏水中。工作液：0.1 取 9mlA 液和 41mlB 液加入 450ml 蒸馏水中，溶液 pH 值为 6.03）5*TBE 液Tris-碱 30.25g，EDTA 0.93g，硼酸 12.84g，加 500ml 蒸馏水工作液为 0.5*TBE4）4%多聚甲醛 称取多聚甲醛 4g，加蒸馏水 50ml，加热至 60，搅拌并加入1mol/lNaOH 数滴，直溶液澄清，冷却后用 0.1mol/lPBS 加至 100ml。5）DEPC 水 加 100ul DEPC 于 100ml 水中，使 DEPC 的体积分数为 0.1。在37温浴至少 12h，然后在约 15 个大气压条件下高压灭菌 20min，以使残余的 DEPC失活。6）Trizol 美国 Invitrogen 生产， RNA 酶抑制剂、 TaqDNA 聚合酶及其反应缓5华中科技大学硕士学位论文冲液 TakaRa 公司生产 、多聚赖氨酸 Sigma 公司生产、 分析用氯仿、 无水乙醇。7）Thrombospondin1 小鼠抗大鼠单克隆抗体 Neomarker of America 生产8）SABC 法免疫组化试剂盒晶美公司提供9）NO 检测试剂盒 南京建成生物工程有限公司10）文迪雅（马来酸罗格列酮 葛兰素史克（天津）有限公司 批准文号：国药准字 H20020475）二、实验方法1、实验模型的建立 将所有大鼠随机分为三组，假手术组（Sham组）18只,模型组（UUO组）18只，治疗组（RSG组）18只，所有大鼠自由饮水进食。各组模型建立方法如下：以10水合氯醛O.3mlkg腹腔麻醉，将大鼠右侧卧位固定于手术台上，剪毛后常规碘酒酒精消毒，行左侧腹切口，暴露左肾，沿左肾下极寻找到左输尿管并游离，在离左肾下极03cm处用丝线上下结扎两道，然后在两道结扎点间剪断输尿管，逐层缝合。Sham组仅开腹并游离左侧输尿管，但不从中结扎和剪断。术前48hRSG组大鼠给予罗格列酮粉剂30mg(kgd)溶解于2ml生理盐水中灌胃，UUO组、Sham组同时以等量的生理盐水灌胃。每组大鼠分别于术后第3天、第7天、第14天各处死6只，心腔灌洗后留取左侧肾脏，分别置于4%多聚甲醛液固定和冻存管于超低温冰箱保存，以备进行肾组织免疫组化染色和mRNA的提取。2.检测方法2.1 肾组织病理学检查肾组织经4%多聚甲醛固定梯度酒精脱水后进行石蜡包埋，然后切片，厚度约为3m，最后切片脱蜡至水行HE和MASSON染色。对肾间质纤维化程度进行半定量评估，分值为04分。0分为正常；1分为肾间质纤维化面积不超过视野25；2分为2549；3分为5075；4分为超过75。计算30个肾皮质高倍视野(400)，求和、取平均数，求得该动物肾间质纤维化分值。2.2 制备肾组织匀浆，检测NO水平称取大约0.6g冷冻肾组织标本，入预冷的生理盐水中漂洗，滤纸滤干，称重后放6华中科技大学硕士学位论文入5ml烧杯内。用移液管取总量生理盐水(生理盐水体积总量约为肾组织块重量的9倍)于烧杯中，用眼科小剪剪碎组织块(烧杯放人冰水中进行)，至预冷匀浆器内研至完全溶解，4静止30分钟，低温离心机离心3000g离心10分钟。取上清液，按照蛋白含量测定说明书加人试剂，利用UV751GD紫外可见分光光度计(选取595nm，lcm光径)测量各组样本吸光度值(0D值1)，代入以下公式：蛋白含量（mg/L）=测量管OD1值/标准管OD1值*标准管浓度（mg/l） 计算出肾组织蛋白含量。肾组织NO含量测定按照N0测试盒说明书加入试剂，再利用U51GD紫外可见分光光度计(选取550nm，05cm光径)测量各样本吸光度值(0D2值)，与测得的各样本蛋白含量代入以下公式：NO含量（mol/mgprot）=(测量管OD2值-空白管OD2值)/（标准管OD2值空白管OD2值）*标准管的浓度/标本的蛋白含量 计算出肾组织NO含量。2.3 免疫组织化学方法检测TSP-1石蜡切片常规脱蜡至水，入0.01mM PH6.0枸橼酸盐缓冲液中微波加热至98-10030min修复抗原，冷却后至PBS缓冲液10min然后染色。染色步骤如下：3过氧化氢液15min消除肾脏内源性过氧化氢酶，PBS洗2min3次以5BSA（小牛封闭血清）封闭20min，滤纸吸干液体滴加小鼠抗大鼠TSP-1单克隆抗体(1：50），湿盒内置于4冰箱孵育过夜PBS洗2min3次，然后加入生物素化羊抗小鼠二抗，室温孵育10min，PBS洗2min3次滴加链霉素一生物素一辣根过氧化物酶复合物工作液，室温孵育30 min，最后用DAB显色，显微镜下控制显色时间最后以苏木素复染、脱水、透明、封片同时以PBS替代一抗做阴性对照。取各组标本的免疫组化切片，高倍镜下(400)用计算机图像分析软件(HMIAS系列多功能真彩色病理图像分析系统)对所选视野内的免疫组化阳性信号进行计算机读片，以阳性染色区域的积分光密度值做半定量分析测定值