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上海交通大学基础医学院硕士学位论文(2008)中文摘要标题:高频电刺激对 PC12 类神经细胞形态结构及功能的影响作者:沃雁导师:丁文龙高频电刺激对 PC12 类神经细胞形态结构及功能的影响摘 要目的:研究细胞外高频电刺激(high frequency stimulation,HFS)对 PC12 类交感神经细胞的形态结构及细胞内 Ca2+、cPKC 和自身 P-PKC的影响,为深入探讨细胞内 Ca2+影响 T H 的表达提供相关实验数据。方法:将HFS作用于传代PC12类交感神经细胞株,HFS参数为:刺激频率130 Hz,通过电流500 A,脉冲宽度60 s;每天固定时间刺激3 h,持续3 d。对照组HFS为零。分别用H E染色、免疫组织化学方法检测经HFS后PC12类交感神经细胞在光镜下形态结构的变化;应用激光共聚焦扫描显微镜观测即刻HFS前后以及连续3 d HFS停止前后单个PC12类神经活细胞内Ca2+动态变化,并通过L型电压敏感钙通道阻滞剂尼非地平(nifedipine,NIF)以证实HFS可引起PC12类神经细胞内Ca2+变化;通过 Western Blot方法检测 HFS后, NIF对经典蛋白激酶 C( conventionalI上海交通大学基础医学院硕士学位论文(2008)中文摘要protein kinase C,cPKC)及其自身磷酸化蛋白激酶C(Phospho-PKC (II),P-PKC)在PC12类神经细胞内表达的影响。结果:与对照组比较,HFS后PC12类神经细胞光镜下突起长度显著缩短,突起个数明显减少(P0.05;Compared beforewith after terminating 3-day HFS the intracellular Ca2+ fluorescence intensity P0.05.2.3HFS后NIF对PC12细胞内Ca2+影响结果加入浓度为 2 M 的 NIF,于刺激即刻前孵育 5 min 后,接入 HFS,刺激开22始前后细胞内荧光强度变化不明显(图 3-A、B),通过线扫描和面扫描两种扫描方式观察细胞内荧光强度随刺激时间延长下降不明显(图 4、5),幅度分别仅为4.8 %和 0.3%,分别与对照组比较均有显著差异 P0.05(表 1)。提示 NIF 抑制了由即刻HFS 引起的细胞内 Ca2+外流的作用。图 3:HFS后 L型钙通道阻滞剂 NIF对 PC12类神经细胞内 Ca2+的影响 A: HFS前;B: HFS后;C:3 d HFS停止前; D:3 d HFS停止后;Fig 3:The effect of L-voltage sensitive Ca2+ channel blocker NIF on intracellular Ca2+ in PC12sympathetic neurocytes after HFSA:Before commencing instant HFS;B:After commencing instant HFS;C:Before terminating3-day HFS; D:After terminating 3-day HFS;2.4连续3 d HFS 对PC12细胞内Ca2+变化结果HFS 的 3 d 组,停止电刺激后,胞内 Ca2+荧光强度逐渐加强(图 2-C、D),23Intensity随刺激停止,线扫描和面扫描两种扫描方式均可以观察到胞内 Ca2+荧光强度迅速上升(图 7、8)幅度分别达 60 %和 3.5 %(图 9),尽管线扫描间隔时间短,速度快会使荧光湮灭,但仍以线扫描荧光强度上升更为显著,考虑与扫描的方式有关,面扫描刺激停止前后 Ca2+荧光值比较结果有显著差异 P0.05(表 1)。提示 NIF 抑制 HFS 的 3 d 组停止刺激后,引起的胞外钙内流的作用,但是从实验数据显示 NIF 并不能完全抑制胞内钙的变化。Line Scanning of 3-day HFS160 140 120 100 80 60Without-NIF2M-NIF40 20 0图 7:线扫描显示,3 d HFS停止后,Without-NIF胞内 Ca2+荧光强度迅速上升;2M-NIF 细胞内 Ca2+荧光强度变化幅度不明显;:3 d HFS停止时间点 14.4ms。Fig 7:With terminating 3-day HFS,Without-NIF intracellular Ca2+ fluorescence increasedrapidly;2M-NIF intracellular Ca2+ fluorescence did not weaken significantly; period was terminated 14.4ms.24:3-day HFSIntensityIncreased of Fluorescence Intensity %Field Scanning of 3-day HFS127 124 121 118 115 112 109Without-NIF2M-NIF106 103 100图 8:面扫描显示,3 d HFS停止后,Without-NIF胞内 Ca2+荧光迅速上升;2M-NIF细胞内Ca2+荧光强度变化幅度不明显;:3 d HFS停止时间点 21s。Fig 8:With terminating 3-day HFS,Without-NIF intracellular Ca2+ fluorescence increasedrapidly;2M-NIF intracellular Ca2+ fluorescence did not weaken significantly; period was terminated 21s.The Effect of NIF on Intracellular Ca2+ in PC12 Cells after Terminating 3-day HFS80 70 60:3-day HFS50 40 30 20 10 0*Without-NIF2M-NIF3-day HFS Line Scanning 3-day HFS Field ScanningScanning Method图 9:3 d HFS停止后,Without-NIF胞内 Ca2+荧光强度迅速上升,线扫描和面扫描上升幅度 分别为 60 %和 3.5 %;2M-NIF组即刻 HFS后胞内 Ca2+荧光强度变化不明显,分别仅为 17.2%和 0.2 %Fig 9:With terminating 3-day HFS,Without-NIF intracellular Ca2+ fluorescence increased rapidlyat respective ranges of 60 % and 3.5 % through both line and field scanning;2M-NIFintracellular fluorescence did not weaken significantly, with respective ranges of only 17.2 % and0.2%*P0.05),仅可检测到较少含量的 cPKC 及 P-PKC,与 Control 组含量接近(图 1、2、3、4)。图 1:HFS后对 PC12细胞内 cPKC含量的影响,Western Blot。 Fig 1:Effect of HFS on amount of cPKC in PC12 cells, Western Blot.32Ratio of cPKC/-actin(%)上海交通大学基础医学院硕士学位论文(2008)第三部分1.2 1.1 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0* #ControlHFSHFS+NIF图 2:HFS后 PC12细胞内 cPKC的表达 Fig 2:Experssion of cPKC in PC12 cells after HFS *P0.01 vs the Control group # P0.01 vs the HFS+NIF group图 3:HFS后对 PC12细胞内 P-PKC含量的影响,Western Blot。 Fig 3:Effect of HFS on amount of P-PKC in PC12 cells, Western Blot.33Ratio of P-PKC/-actin(%)上海交通大学基础医学院硕士学位论文(2008)1.61.41.210.80.60.40.20* #第三部分ControlHFSHFS+NIF图 4:HFS后 PC12细胞内 P-PKC的表达 Fig 4:Experssion of P-PKC in PC12 cells after HFS *P0.01 vs the Control group # P0.01 vs the HFS+NIF group3、讨论PD被列为第二大神经退行性疾病,以静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势反射障碍等临床特征严重影响患者生活质量。造成PD的原因十分复杂,包括氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、线粒体功能障碍、细胞炎症和凋亡以及蛋白质酶学活性的生物学功能障碍等,是多个致病基因、多种致病因子(环境因素)和多条致病途径之间错综复杂交互作用的结果。但什么因素起关键作用,什么因素是继发环节仍然不得而知。调控细胞蛋白质酶学活性的重要物质PKC在PD的发病过程中起重要作用。迄今为止所发现的PKC分类中,cPKC是PKC家族中的一种亚型,属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶范畴,同时能被Ca2+激活,从而通过其自身磷酸化调节细胞代谢,分化增殖等8,9。最近已有实验证明PKC家族中的亚型结构是一个氧化应激敏感的激酶,在PD模型细胞的凋亡中起关键调节作用10。对于PD的治疗方式也多种多样。包括药物治疗的标准方法左旋多巴的应用,单34上海交通大学基础医学院硕士学位论文(2008)第三部分侧苍白球(unilateral pallidotomy)毁损术(ablation surgery)和底丘脑核团(subthalamicnucleus,STN)的DBS等。尤其是DBS已经被认为是治疗PD患者的标准方法11。然而通过高频电流刺激治疗PD的机制至今无法给出一个令人信服的解释12。以往通常认为HFS导致细胞质膜电位差,通过对去极化抑制神经元的活性13,14,15。最近Garcia16等人提出高频电流刺激治疗PD存在双重效应,抑制病理性神经元的同时对神经细胞给予新的节律性定向刺激。大量的研究一直试图尽快找到HFS能治疗PD的根本原因。PKC作为细胞信号转导通路中心分子之一,通过对酶蛋白等蛋白质的磷酸化调节自身的活性。cPKC属于PKC的亚型,存在于神经组织中,对Ca2+敏感,可以被Ca2+激活,通过其自身磷酸化调节神经细胞代谢。我们的研究基于细胞分子水平,通过建立经NGF诱导分化PC12为类交感神经细胞体外PD细胞模型,采用与临床治疗PD接近的电流刺激参数17,18,检测电流刺激结束后细胞内cPKC及P-PKC的表达。结果发现经HFS处理后,PC12类神经细胞内的cPKC含量明显增加,但这不能说明cPKC可以被HFS激活,通过检测其自身P-PKC的表达发现,其P-PKC水平同样有显著升高,可见HFS激活细胞内cPKC。以往实验已证明HFS能够改变细胞单钙通道19。本实验的前期实验也证实HFS导致细胞内Ca2+升高。为了进一步探讨HFS是通过何种途径引起PC12类神经细胞内cPKC及P-PKC的表达增加,我们选用L型电压敏感钙通道阻滞剂NIF阻断细胞质膜上部分Ca2+通道,结果发现经NIF处理后,细胞内cPKC及P-PKC的表达均无明显增加。这一结果与以往研究一致,cPKC活性呈Ca2+依赖性
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