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膜片钳实验技术入门-基本原理与操作 关兵才 李国华 刘理望 按:本文乃于 2003 年根据较旧型号的仪器写成,后被机能实验科学 (郑先科主编,北大医学版,2006)收入。因新旧仪器基本原理和操作步骤大同小异,现对原文略作修改和标注,供同学们参考。 【实验目的】 1. 了解膜片钳技术的基本原理和操作。 2. 初步学习电压依赖性离子通道电流的基本记录方法。 【实验原理】 一、膜片钳技术原理简介一、膜片钳技术原理简介 膜片钳(patch clamp)是一种主要用于检测细胞膜离子通道活动的电生理技术,按工作 方式可区分为电压钳(voltage clamp)和电流钳(current clamp)。电压钳电压钳是最基本的工作方式, 即对细胞膜电位进行人为控制, 如将膜电位钳制于某一固定水平, 或在此基础上再施以阶跃 (step)式或斜坡式(ramp)电压刺激,同时记录跨膜电流,从而分析细胞膜通道的活动。电流钳电流钳 即人为控制经微电极对细胞进行注射的电流(等于离子通道电流与细胞膜电容电流之和) , 同时记录膜电位及其变化。若注射电流为零即常用的零位钳流,用于测量细胞膜静息电位, 若注射方波脉冲刺激电流,用于诱发、观测动作电位。另外,膜片钳技术还常用于观测细胞 膜电容, 从而推测分泌细胞的活动情况。下面主要介绍其电压钳工作方式的基本原理。 (注:注:在电生理资料中,因通常将细胞外液和记录系统的“地”点相连作为参考点即零电位点,所以电位和电压两个概念经常混用。 )。 ) 根据膜片钳实验中受检细胞膜的型式(configuration)不同,又可将膜片钳分为全细 胞式(whole-cell)、细胞贴附式(cell-attached 或 on-cell)、内面朝外式(inside-out)、 外面朝外式(outside-out)等四种模式。 (一)全细胞式 (一)全细胞式 1电压钳制和电流记录的实现 1电压钳制和电流记录的实现 图 9-9 为全细胞式膜片钳工作原理示意图。 图 9-9 全细胞膜片钳实验原理示意图 图 9-9 全细胞膜片钳实验原理示意图 A1:运算放大器;:运算放大器;A2:单倍增益差动放大器;:单倍增益差动放大器;Rf:反馈电阻;:反馈电阻;Vp:电极电位(:电极电位(A1反向输入端电位) ;反向输入端电位) ;Vc:A1同向输入端电位;同向输入端电位;Cin:输入端杂散电容;:输入端杂散电容;Cp:电极电容;:电极电容;Rs:串联电阻;:串联电阻;Cm:细胞膜电容;:细胞膜电容;Rm:细胞膜电阻;:细胞膜电阻;Em:细胞膜内在电位:细胞膜内在电位(指钳压时的细胞膜诸通道状态决定的内在指钳压时的细胞膜诸通道状态决定的内在Goldman-Hodgkin-Katz平衡电位平衡电位);Vo:A2输出端电位;输出端电位;V-offset:偏移电位补偿电位;:偏移电位补偿电位;Cc:用于电容补偿的电容;:用于电容补偿的电容;Vc(app):表观钳制电压即欲施加于受试膜片的电压;图中:表观钳制电压即欲施加于受试膜片的电压;图中 和和 表示求和电路表示求和电路 将充有电解质溶液的玻璃微电极(glass microelectrode或 recording pipette)利用负压紧密吸 附于细胞表面,形成吉欧即千兆欧(109)级高阻封接, 进一步对微电极内施加负压、将 细胞膜吸破,形成全细胞膜片钳记录模式。玻璃微电极内的电解质溶液通过Ag/AgCl电极与 探头的信号输入端(从信号钳制角度讲也是输出端)相连接,细胞浴液通过Ag/AgCl电极与 探头的信号地端相连接。膜电位的人为钳制,乃靠高开环放大倍数、低偏流、低噪声的运算 放大器(以下简称运放)A1在深度负反馈工作状态下的“虚短路(virtual short circuit) ”原 理实现,即只要A1工作于线性范围内,其反向输入端的电位Vp总是等于同向输入端的电位 Vc,这两个输入端之间虽非短路却类似于短路。因此,只要人为对Vc予以控制,则Vp总是 “跟随”Vc而变,使Vp=Vc (严格讲并不一定完全相等,多数情况下二者十分接近,其差异 对于研究细胞膜电生理而言完全可以忽略)。该“虚短路”现象,实质是由于A1对两个输入 端间出现的电位差高度敏感,Vp和Vc之间欲出现明显差异时(如跨膜离子流动引起Vp变化 时,或人为改变Vc时) ,通过负反馈电阻Rf迅速对反相输入端“补充”或“卸除”电荷来调 节Vp,使之总与Vc十分接近或相等。图中A2为单倍增益差动放大器,其输出端电位Vo等于 两输入端电位之差。结合运放A1的“虚短路”原理和单倍增益差动放大器A2的工作特点, 可得: V1 = Vp-IRf = Vc-IRf Vo = (V1-Vc) 1= (Vc-IRf )-Vc = -IRf 其中I为流经反馈电阻Rf的电流,另据运放的“虚断路(virtual open circuit)”原理,即通 过其两个输入端进入或流出运放的电流极小,类似断路,若各种补偿调节完成后,则跨膜电 流基本上等于流经Rf的电流I。可见,A1、Rf和A2构成一个“电流-电压转换器(current-voltage converter)” ,将跨膜电流在A2的输出端以电位Vo(= -IRf)的形式测得。 2参数的补偿参数的补偿 为了使膜电位的钳制准确而快速地实现, 并使输出信号较好地反映离子通道的电流, 需 进行多种参数补偿,下面只介绍和实验操作密切相关的几种: (1) 电容补偿电容补偿(capacitance compensation):在监视细胞封接、破膜过程以及研究电压门 控离子通道的特性时,须在Vc端施加阶跃电压刺激,如常用的方波电压刺激,即先后施加两 个方向相反的阶跃刺激。只要有电位的阶跃,由于微电极、放大器输入端及其间的连接等均 可造成对地“杂散电容(stray capacitance)”而产生时间常数短的“快电容充放电电流” ;在全 细胞模式又因细胞膜电容(membrane capacitance)的存在而出现时间常数较大的 “慢电容充放 电电流”(有些放大器在参数设计名称上有异,详见下面的注释)。这些电容电流既非我们欲记录的信号, 且其作为电流伪迹会对一些快电流信号(如钠电流)的记录产生干扰,此外还有可能使放大 器饱和(即超出放大器的线性工作范围使记录结果失真) ,故需将其从放大器输出端信号中 消除。 补偿的原理为在运放A1的反向输入端接一电容Cc, 电容另一端接由方波刺激电压驱动 的指数电位发生电路(exponential voltage generator) ,调节此电路的增益和时间常数,使其 向Cc注射的电流和欲消除的电容电流同步性对等补偿,这相当于将电容电流“引流”到Cc支 路,从而不再因流经Rf而在输出端体现。 (2) 串联电阻补偿串联电阻补偿(series resistance compensation):因为电极尖端直径小,而且在全细 胞模式时有细胞膜残片阻挡在电极口处, 故有数兆乃至十余兆的电阻值, 因此电阻与全细胞膜片相串联, 故称为 “串联电阻 (series resistance , Rs) ” 【不少资料将串联电阻称为入口电阻 (access resistance, Ra), 而将封接电阻称为Rs (seal resistance),请注意区别】。若跨膜离子电流流经Rs,会造 成细胞膜钳压偏移;若电容电流流经Rs,会造成对细胞膜钳压的速度降低。对于前者,可 用图中的正反馈“校正电路(correction circuit)”予以补偿,即根据跨膜电流大小确定自输出 端Vo向同向输入端Vc的反馈补偿量,从而使Vm和Vc尽管不等,但和欲施加的钳位水平(图 中用Vc(app)即表观钳位值表示)尽量接近。对于后者,可用“增压电路(supercharge circuit)” 予以补偿,因为电容电流被补偿之后不再于输出端Vo中体现,故无法再用上述校正电路反 馈补偿钳压速度。 增压电路的作用为使电位阶跃初始幅度加大, 其后再返回正常阶跃欲达到 的水平,从而使膜电位能迅速地改变。 (3) 偏移电位补偿偏移电位补偿(offset voltage compensation):由于电化学效应在金属/金属难溶盐电 极与电解质溶液间、不同的电解质溶液之间存在着相界电位(其中后者称为液接电位,也有 人将二者均称为液接电位) ,放大器输入端本身也有偏移电位。微电极进入浴液后,这些相 界电位使运放两输入端的电位明显失衡,使放大器饱和。 “偏移电位补偿”即在Vc端叠加一 个直流电位,从而使钳压实验之前两个输入端的电位平衡、放大器输出值为零。钳压实验中 施于细胞膜的钳制电压实际上是叠加于此直流补偿电位之上的。 (4) 漏电流减除漏电流减除(leak subtraction):若用阶跃电压刺激细胞膜,会引起相应的背景线性 漏电流响应(即假定膜电阻不变时,和阶跃刺激电压成正比的电流),若该刺激引起了通道的活动, 则通道活动电流会叠加于此漏电流之上。 为了更清楚地观察通道活动电流, 通常用电路或程 序将此背景漏电流减除,简称“漏减” 。值得注意的是, “漏电流”指背景线性电流,并非仅指细胞与微电极之间封接间隙泄漏的电流,还包括背景状态的离子通道以及膜电容所介导的线性电流响应。是否需要做漏减,须根据通道活动电流(常称作主动电流)和背景漏电流(常称作被动电流)的相对大小而定。 (二)细胞贴附式 (二)细胞贴附式 将充有电解质溶液的玻璃微电极紧密吸附于细胞表面形成吉欧封接后,不吸破电极下 的膜片, 而是在一定的钳压条件下记录该膜片所含通道 (可含有一个或数个通道) 活动电流, 即为细胞贴附式膜片钳(图 9-10) 。 图 9-10 细胞贴附式膜片钳实验示意图 PCA:膜片钳放大器;:膜片钳放大器;RP:静息电位;:静息电位;Vp:电极电位(膜片钳放大器输入端电位) :电极电位(膜片钳放大器输入端电位) 1静息电位影响的消除静息电位影响的消除 由于外侧大膜片的存在,受试小膜片两侧的电压为Vm=RP-Vp,所以必须考虑静息电位 RP的影响。消除其影响的方法有: ()通过对一定样本的此种细胞用全细胞电流钳方式测 得其平均静息电位,根据Vm=RP-Vp,确定若欲施加于受试膜片两侧电压Vm所对应的Vp值。 但若仪器的钳压显示值不是Vm,会使钳压操作欠直观、不方便。故往往将RP作为一种“偏 移电位”补偿掉,即将RP视为零水平,从而令仪器的钳压显示值仍为Vm。另外,由于细胞 贴附式实验时受试膜片内、 外面和全细胞式相反, 通常电路设计或软件处理考虑到习惯问题,使Vm的显示值为-Vp。 ()令浴液中钾离子的浓度和细胞内液钾离子浓度尽量接近,使RP 接近于零。 受试膜片通道活动不足以使 RP 明显变化而影响钳压。 但若有药物作用于外面的大膜片 而使其上的通道有明显活动, 则会使大膜片两侧的电压明显变化而影响受试膜片的钳压, 这 一点在细胞贴附式实验设计中应注意避免。 2外侧大膜片的电阻和电容的影响简析外侧大膜片的电阻和电容的影响简析 由于外侧膜片的面积远较内侧受试膜片为大,所以前者的直流电阻远小于后者,当外 加电压Vp或Vp时,主要作用于受试膜片。膜电容的影响勿需考虑,因为内侧受试膜片和 外侧大膜片各自等效于一个RC并联电路,从Vp点和零电位点之间看进去,这两个RC电路又 相互串联, 且其RC值大致相等, 故二者的电容效应在电压阶跃过程中恰好能够相互补偿。(注:有兴趣的同志可参见秦曾煌主编电工学第五版上册 208-209 页) 另外,细胞贴附式实验中需调节快电容补偿,也可于小补偿范围档调节慢电容补偿, 进一步消除用快电容补偿不能消除的电容电流。因单通道电流很小,串联电阻亦较小,故不 必使用串联电阻补偿。 为了便于数据分析最好使用漏减功能, 尽管单通道活动电流和漏电流 有时不难鉴别。 (三)内面朝外式和外面朝外式 (三)内面朝外式和外面朝
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