种高灵敏度测定血红蛋白的化学发光分析方法庞志涛，胡涌刚 ( 华中科技大学环境科学与工程学院，武汉4 3 0 0 7 4 )本文采用流动注射方法研究了L u m i n o l K n ( C N ) e 一牛血红蛋白( m ) 化学发光反应，考察了流速、发光试剂浓度、p H 值以及增敏剂等对牛血红蛋白分析检测的影响，建立了一种测定牛血红蛋白的化学发光新方法。牛血红蛋白的线性范围为1 2 9 1 0 o l L 一5 1 8 1 0 。1 0m o l L ，r 2 = 0 9 9 8 5 ；检出限( S N = 3 ) 为5 O 1 0 o m o l L ：回收率为1 0 0 l O ：R S D 5 ( n = 6 ) 。蛋白质定量测定在临床医学和生命科学的研究中有着重要的意义“1 。常见蛋白质测定方法的报道，其中大多是利用蛋白质与生色探针的结合作用，生成有色复合物后以分光光度法测定。1 ，少数是将蛋白质用卟吩、四环素等荧光探针标记后，用荧光光度法测定“，也见有蛋白质电分析方法的报道“在实验过程中，我们首次发现了牛血红蛋白具有有效催化L u m i n o l K 3 F e ( C N ) e 反应并产生很强发光的性质，并通过优化各种反应条件，建立了 一种测定准确、灵敏、高选择性的化学发光测定牛血红蛋白新方法。 l 实验部分 1 1 主要仪器与试荆流动注射化学发光仪( 自制) ：N - 2 0 0 0 色谱工作站( 浙江大学智达信息工程有限公司) ； 8 1 8 型酸度计( 美国奥立龙公司) 。牛血红蛋白标准溶液1 0 m g m L ：鲁米诺储备液：2 O Xl O - 2 t 0 0 1 L ；铁氯化钾储备液：0 0 5 m o l L ；溴化十六烷基三甲基胺( C T M A B ) 溶液：1 0 1 0 m o l L ，临用前稀释：其它 所用试剂均为分析纯，实验用水为二次去离子蒸馏水。1 2 实验方法于5 0 m L 容量瓶中依次加入C I “ M A B 溶液，一定体积的牛血红蛋白标准溶液，调节p H 值，以二次去离子蒸馏水定容。摇匀。然后经蠕动泵输入。 2 结果与讨论2 1 流路参数的选择实验表明，当蠕动泵转速味5 O m L m i n ，流通管内径为0 8 m m ，采样管长l O c m ，润池 距为8 c m 时，测定具有最大的信噪比。2 2 反应条件的选择2 2 1 鲁米诺浓度的选择鲁米诺浓度不仅影响测定的灵敏度，而且还影响测定的线性范围。相对发光强度随着鲁米诺浓度的增大，当鲁米诺浓度超过1 3 l O - 6 m o l L时，噪音增幅则会超过信号的增幅，相对发光强度降低。为了获得最佳的信噪比，选择 的鲁米诺浓度为1 3 1 0 “n 1 0 1 L 。2 2 2 铁氰化钾浓度的选择铁氰化钾浓度的大小对化学发光反应有较大的影响，当铁氰通讯呋系人：胡涌刚，T e l ：0 2 7 8 7 5 4 4 1 8 4 8 2 ，E - - m a l l ：地B g 牡g 虹墅l 笪：卿( 本文受国家自然科 学基金资助项目代号为：2 0 0 0 5 0 0 5 )3 4 1化钾浓度增大到2 O X1 0 。m o l L 时达到最高；但是，随着铁氰化钾浓度的继续增大，该反应的相对发光强度反而降低。这可能是由于高浓度铁氰化钾对发光信号有部分吸收的缘故。故本文选铁氰化钾浓度为2 O 1 0 “ 4m o l L 。2 i 3 体系p H 值的选择在p H l l 0 1 3 6 范围内，同时改变铁氰化钾与鲁米诺的p H 值并考察其对化学发光反应的影响，结果表明，发光强度和信噪比( S N ) 在p H = 1 3 0 时均达到最大。 2 I 4 试样p H 值的选择样品的酸度在一定的范围内对化学发光反应有影响：在p H l 2 O 1 3 6 范围内，化学发光信号随着牛血红蛋白水溶液的p H 值升高而增大：当样品 的p H 值达到1 3 0 后，化学发光信号基本达到最大。2 1 5 增敏剂浓度选择溴化十六烷基三甲基胺( c T 煳) 对该体系的发光具有明显协同催化作用，L u m i n o - K l F e ( c N ) e - B S A 体系的发光信号在一定浓度范围内随着式样中C T M A B 的浓度增加而增大，并且在试样中的C T M A B 浓度为2 5 x 1 0 1m o l L 情况下达到最大。 2 3 线性范围、检出限与精密度在最佳的试验条件下，H B 浓度在1 2 4 X l O o m o l L - - 3 1 l O 。m o l L 范围内呈良 好的线性关系，回归方程为：Y = 6 E + 0 9 X + 8 2 1 6 4 ( v = 0 9 9 8 5 ) ；检出限( S N = 3 ) 为1 2 4 1 0 “ o m o l L ：2 ，4 干扰实验在选定的实验条件下，考察了多种物质共存时对浓度为1 1 0 1 m g m L 的璐发光强度的影响，试验结果表明：5 0 倍的亮氨酸无干扰：5 0 0 倍的丙氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、天冬酰胺、赖氨酸和谷氨酸无干扰；i 0 0 0 倍的甲醇、乙醇、肋T 、S O , 、N 0 3 。、F 、1 0 0 倍的C t t C l ，、乙腈、大量的N a + 、K + 不干扰实验；B r 一严重干扰；加入很低浓度的c o 。、N i ”、c u “、P b ”、M 矿、F e 、A 1 ”、z n 2 + 、C 分+ 等金属离子都对B S A 的发光强度有影响；对此，在试样中加入E D T A 后所有金属离子不干扰蛋白质的测定。 2 5 回收率试验表1 为几种不同标样加标回收率的实验结果。结果表明：加标回收率在1 0 0 1 0 范围 内，准确度较好。( m o l L )参考文献：1 管正大，屠学磴疆描j 宸武e 再织北京，人民军医出版社，1 9 9 4 ：1 7 6 2 郑铁生狄兆俊，张萍) ，磁獗崔爱 髯1 9 9 2 ，1 0 ( 4 ) ：i 7 4 3 孙伟，焦奎，刘晓方，分砻耽 毫2 0 0 2 ，3 0 ( 3 ) ：3 1 24 胡秋娈，李娜，赵风林等，分析纪 专1 9 9 9 ，2 7 ( 2 ) ：1 6 6