第二军医大学博士学位论文中文题目：变应性鼻炎补体及补体诩节蛋白基因表达、蛋白检测的实验研究英文题目：G e n eE x p r e s s i o na n dP r o t e i nD e t e r m i n a t i o no fC o m p l e m e n t sa n dC o m p l e m e n tR e g u l a t o r yP r o t e i n si nt h eN a s a lM u e e 蝗ao f A l l e r g i cR h i n i t i sR a t研究生姓名：郎军添指导教师：孙爱华教授导师小组成员：范静平教授赵舒薇教授王海青副教授专业：耳鼻咽喉科学研究起止时间：2 0 0 3 年1 2 月至2 0 0 5 年3 月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：懈签字日期：幻吟一年y 月f j 曰学位论文使用授权书声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部f 1 或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：啷颦0 螽导师签名：签字帆硝年y 刖日签字日期泸再如日缩略词一一一一缩写词中英文对照简表缩写词英文全名岛C 4C sC a a RC s a RC R P( R C AM C P , C D 4 6C I 坷N Ho 、，AA Rc o m p l e m e n tc o m p o n e n tC 3c o m p l e m e n tc o m p o n e n tC 4c o m p l e m e n tc o m p o n e n tC 5如ar e c e p t o rC s ar e c e p t o rc o m p l e m e n tm g u i m o v 3p r o t e i n sr e g u l a t o r so f c o m p l e m e n ta c t i v a t i o nm e m b r a n ec o f a e t o rp r o t e i n ，C D 4 6C Ii n h i b i t o rO V a b l u ma l l e r g i cr h i n i t i sM e s h “ r e r m sc o m p l e m e n tC 3c o m p l e m e n tc 4c o m p l e m e n tC 5m e m b r a n ec o f a c t o rp r o t e i n ，C D 4 6CaI n h i b i t o ra l l e r g i cr h i n i t i sg e n e sg e n ee x p r e s s i o np r o t e i nr a t中文全名补体成分C 3朴体成分c 4补体成分c 5补体C 碉受体补体C 5 a 受体补体调节蛋白补体活化凋节因子)补体膜辅蛋白补体C - 抻制因子卵清蛋白变应性鼻炎中文主题词补体c 3补体C 4补体C 5膜辅蛋白因子，C D 4 6补体c j 抑制园子变应性鼻炎基因基因表达蛋白大鼠中文摘要中文摘要变态反应性鼻炎是世界范围内的临床常见病，属I g E 介导的I 型变态反应。补体是机体免疫系统的重要组成部分，补体在免疫复合物型变态反应性疾病中所起到的作用已被广泛所认同，近年的l 临床和实验研究表明，补体活化产物( 过敏毒素C 3 a 和C s a )在I 型变态反应性疾病的病理生理过程中也发挥了一定作用，其中包括荨麻疹，过敏性哮喘及变应性鼻炎等。正常生理条件下，补体的活化受到补体调节因子的调控。在变应性鼻炎中补体究竟通过何种方式激活，补体及补体受体的基因表达有否变化，补体调节蛋白是否参与了变应性鼻炎的病理过程，尚未见报道。我们力图通过研究补体及补体调节蛋白在变应性鼻炎中表达的变化，探讨补体及补体调节蛋白在变应性鼻炎发病中的作用，以期进一步揭示变应性鼻炎的发病机制，并为将调节补体活化或应用补体抑制剂调控补体活性作为治疗变态反应性鼻炎奠定基础。目的：研究补体C ”C 4 及补体调节蛋白C I I N H 、M C P ( C D 4 6 ) 在大鼠变应性鼻炎中m R N A 表达和翻译的变化，证实补体及补体调节蛋白在变应性鼻炎发病中的作用，以期进一步揭示变应性鼻炎的发病机制。方法：健康、无鼻疾成年S D 大鼠2 5 只，随机分为2 组，一组1 5 只实验组，另组为对照组1 0 只。实验组应用O 1 卵清蛋白辅以氢氧化铝佐剂建立变应性鼻炎大鼠模型，对照组给予生理盐水。取大鼠呼吸区鼻粘膜，采用R T P C R 方法检测其中补体c 3 、C 4 及补体调节蛋白C D 4 6 的表达情况，并应用W e s t e r n B l o t t i n g 方法检测组织中补体c 3 、c 4 及补体调节蛋白C 1 - I N H 、C I M 6 的蛋白含量，进行对比。结果：实验组及对照组中均有C 3 、c 4 表达，变应性鼻炎组与正常对照组比较实验组c 3 的m R N A 表达水平与对照组相比有有显著差异( p O 0 5 ) ，实验组鼻粘膜补体成分c 4 表达水平无上调。C D 4 6 在实验组和对照组也都有表达，两组表达水平差异显著( p O 0 5 ) 。补体调节因子C D 4 6 含量两组间差异显著( p 结果检测I 组织样品的蛋白质抽提试剂：奄自型龌遗圆崮邀】T r i sI Ml m lE D T A0 5 M0 4 m IN a C I5 M3 m lB 埔9 61 0 8 7 5 m lN P 4 01 0 I 2 5 m l补水至总体积为1 0 0 m l蛋白酶抑制剂：L e u p e p t i n2 5 p M ；A p r o t i n i n2 5 I _ t M ；A E B S F2 5 p M1 0 0 m lB r i j 液需加入至少两种蛋白酶抑制荆共1 0 0 u ll O 的分离胶使用。 抠屋胶遮度垒竖始3 0 ：0 8 w v 丙烯酰胺：双丙烯酰胺6 6 0u ll m l1 MT r i s - C 1p H 6 86 3 0u l6 3 0u l2 0 S D S2 5 u l2 5u ld n 2 03 6 m l3 6 m l混合，灌胶前加入A P S 和T E M E D1 0 川P sT E M 匣D总体积2 5 u I5 l I l5 m l2 5 u l5 u l5 m l使用W h a t m a n3 m m 滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液，如上配制积层胶。用1 0 m 1注射器将积层胶加入板中至顶端，小心插入梳子，注意不要产生气泡。凝胶聚合1 小时左右1 8 材料# 方法( 3 ) 样品准备：上搓整遗( 坠垄盟匹! i 上搓鎏遗)3 基缝珏退1 MT r i s - C Ip H6 82 4m l2 0 S D S3 m l甘油( 1 0 0 )3m l0 巯基乙醇1 6 m l溴酚蓝O 0 0 6 9总体积1 0 m l ( 储存于4 0 C )准备l x 上样缓冲液的样品液：如6u l 蛋白样品加入3u l3 X 上样染液储存液。每孔配制含5 0 u g 总蛋白样的样品液。上样前煮沸3 分钟。( 4 ) 加入电泳缓冲液，上样：凝胶电泳前，拔去梳子。每孔均用l 电泳缓冲液清洗。上、下层电泳槽中加入l 电泳缓冲液，上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端1 到2 c m 。B i o R a d 电泳槽中器加入5 0 0m l 的1 X 电泳缓冲液( 5 0m l 的1 0 3 ( 储存液+ 4 5 0m ld H 2 0 ) 。将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中。( 5 ) 电泳：使用B i o R a d 电泳装置，样品首先在2 0m A 恒定电流下电泳至染料接近分离胶顶端。然后6 0 m A 恒定电流电泳至溴酚蓝刚出胶底部。凝胶电泳于4 “ C 。4 蛋白质转移试剂：强S 碱甘氨酸甲醇( 1 ) 准备好B i o - R a d 蛋白转移装霞夹板，凝胶用l x 转移缓冲液稍微清洗。( 2 ) 吸水纸，滤纸( 比凝胶稍微大一些) 用l x 转移缓冲液预湿，如下顺序装配于转移装置上。吸水纸一滤纸一凝胶一P V D F 膜一滤纸一吸水纸材料与方j 盘( 3 ) 3 0 m A 恒流条件下，4 0 c 转移过夜。! 苎鞋整援挫遗一“ I r i s 碱1 5 1 4 9甘氨酸7 2 0 7 9甲醇l L加水至总体积为S L5 膜的封闭和抗体孵育试剂：T B S F F ：1x T B S ( T r i sB u f f e r e dS a l i n e ) ，0 1 吐温- - 2 05 脱脂奶粉水溶液一级抗体H o r s e r a d i s hP e r o x i d a s e ( H R P ) 结台的二级抗体 珏冲结台的抗生物素抗体( I ) 膜在5 脱脂奶粉水溶液中室温孵育l 小时以封闭膜上的非特异结合。T B S T 洗膜3 次，每次5 分钟。( 2 ) 封闭过的膜加入一缀抗体室温孵育1 5 小时，抗原抗体结合。T B S T 洗膜3 扶，每次5 分钟。( 3 ) 加入H R P 标记的二级抗体以结台一缎抗体及H R P 标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1 小时。T B S T 洗膜3 次，每次5 分钟。6 结果检测试剂：S u p e r S i g n a i 。W e s tP i e oC h e m i l u m i n e s c e n tS u b s t r a t eK i tO 0 5 ) 。实验组鼻粘膜补体成分C 4 表达水平无上调。C I M 6 在实验组和对照组也都有表达( 图6 ) ，长度为2 9 1b p ，符合预期的目的片段长度。经t 检验分析两组差异显著( p 娜0 5 ) ，实验组C D 4 6 表达水平明显高于对照组。内标准1 3 a c t i n 对照组和实验组均表达恒定。C 3 、C 4 及C D 4 6 目的片段电泳条带的灰廑值见表5 。表5 C 3 、G 及C D 4 6 P C R 结果实验组对照组 值C 36 1 9 3 2 + _ 1 3 7 6 24 4 4 4 2 8 + _ _ 9 8 8 60 0 5C D 4 61 4 0 8 9 2 + 3 1 5 1 89 2 4 8 2 1 9 8 8 2 司D 0 5图4 C 3 m R N A R T - P C R 电泳图( 1 i n e1 1 0 为对照组，l i n e1 1 - 2 0 为实验组)图5 C m R N A R T - P C R 电泳图( 1 i n e1 1 0 为对照组，l i n e1 1 - 2 0 为实验组)，2 4 图6M C P m R N A R T - P C R 电泳图( 1 i n e1 - 1 0 为对照组，l i n e 】1 - 2 0 为实验组)图7口- a c t i n m R N A R T -