中山大学博士学位论文低剂量的E C P s 诱导机体 适应性反应差异表达基因的研究学位申请人：卫秦芝专业：卫生毒理学导师：庄志雄教授论文答辩委员会成员主委席：磁，员：f 睁C 十如一够t 袅呻列麟中山大学公共卫生学院二零零五年五月低剂量的E C P s 诱导机体适威性反应差异表达摹因的研究中山大学博十学位论文低剂量的E C P s 诱导机体适应性反应差异表达基因的研究卫生毒理学博士研究生：导师：摘要卫秦芝庄志雄教授机体及其细胞经常受到各种环境因子的作用。环境中存在着物理、化学和生物等不同因子，它们引起机体和细胞的反应特点，一方面受制于机体固有遗传结构的进化发育阶段和功能状态，另一方面取决于环境因子的性质和剂量。随着工业的发展，环境化学因子日益增多，其对健康的影响受到关注。近年来，高浓度接触所致急性中毒和损伤在人们的努力下已大为减少，而代之低浓度，甚至是极低浓度的接触，这些接触和高浓度接触在健康效应上有着什么样的区别；在进行危险度评定和管理中应采取什么样的策略；在保护环境和人体健康的前提下，如何更好地促进化学工业的发展；是人们更为关心的问题。所以，低水平的环境化学因子诱导机体产生的生物学效应和机制及其对人类健康评定的影响成为目前毒理学领域研究的热点。本研究建立了E C P s 包括过氧化氢( H 2 0 2 ) 、甲醛( F A ) 、三氯乙烯( T C E ) 、氢醌( H Q ) 诱导细胞适应性反应的模型，并用荧光差异显示P C R 技术寻找不同处理差异表达的基因，通过进一步的鉴定和验证，为探讨低剂量的E C P s 诱导细胞适应性反应的机制提供科学依据。方法：1E C P s 诱导细胞适应性反应模型的建立低剂量的E C P s 诱导机体适应性反应差异表达基闲的研究中山大学博+ 学位论文用一系列剂量的H 2 0 2 对人胚肺成纤维细胞( M R C 一5 ) 进行染毒，M T T 法获得H ：0 ：对细胞毒性的剂量效应关系和时问效应关系。选择对细胞没有损伤或者有增殖效应的剂量为低剂量，对细胞有明显损伤效应的剂量为高剂量，然后用低剂量的毒物预刺激细胞一定的时间后，继而用大剂量的同一毒物攻击，观察细胞的损伤效应，将低剂量预刺激后可以减轻继而大剂量攻击的损伤效应的一组剂量作为适应型反应模型的剂量。用乳酸脱氢酶漏出率( L D H ) 、A n n e x i nv P I 检测细胞凋亡来验证H 2 0 2 诱导M R C 5 适应性反应的模型。F A 、T C E 、H Q 的剂量效应关系及其适应性反应模型的建立由课题组的其他科研人员进行。2 荧光差异显示P C R 寻找不同处理组差异表达的基因H 2 0 2 、F A 、T C E 、H Q 分别对细胞进行染毒，按：对照组、低剂量组、高剂量组，适应性反应组处理细胞，在各组细胞染毒终止后，提取细胞总R N A ，用无R N A 酶的D N A 酶清除污染的D N A ，紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳分别检测其纯度和完整性。优化荧光差异显示P C R 的锚定引物( A P s ) 和随机引物( A R P s ) ，然后用A P s 进行逆转录( R T ) 反应，合成c D N A ，再用优化的A P s 和A R P s组合，进行荧光差异显示P C R ，最后进行5 6 聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过G e n o m y x S C 扫描系统扫描，用系统所带的A c q u i r e S C 软件进行定位，分离差异表达的基因。3 差异条带的再扩增、克隆、鉴定、测序及同源性比较选择感兴趣的差异条带进行再扩增，电泳鉴定后，克隆到p G E M T 载体，对阳性重组菌通过菌落P C R 鉴定，测序。然后将获得的序列和N C B I 上提供的包括G e n e B a n k + E M B L + D D B J + P B D 的核酸序列数据库B L A S T ，进行同源性分析。4 用荧光定量P C R 方法验证目的基因是否差异表达将H 2 0 2 处理的各组细胞的总R N A 进行常规R T ，然后以e D N A 为模板，根据条带的测序结果按荧光定量P C R 要求设计引物，采用S Y B RG r e e nI 荧光染料相对定量的方法检测基因的表达。以1 3 - a c t i n 为内参，通过目的基因和内参的标准曲线来保证两者的扩增效率相同，以便相对定量。熔解曲线消除引物二聚体对结果的影响。然后进行相对定量验证所得目的基因是否差异表达。结果lE C P s 诱导细胞适应性反应模型的建立I I低剂量的E C P s 诱导机体适廊性反应差异表达摹因的研究中山人学搏_ 土学位论文用0 、O 0 8 8 、O 8 8 、8 8 、8 8 、8 8 0 、l1 0 0 、2 2 0 0 、4 4 0 0 、8 8 0 0 “r n o l L 的H 2 0 2对M R C 5 细胞染毒6 h ，通过M T T 法获得对M R C 5 毒性的剂量效应关系，发现O 。0 8 8 8 8 9 m o l L 范围内的H 2 0 2 对细胞几乎没有损伤( p O 0 5 ) ；从8 8 0 1 x m o l L 丌始，H 2 0 2 对细胞有明显损伤( P O 0 5 ) 。所以将0 ，0 8 8 、O 8 8 、8 8 、8 8 1 a m o l L 作为低剂量，预刺激细胞2 4 h 后，然后把1 1 0 0 l z m o t L作为高剂量刺激细胞1 h 。观察发现用O 0 8 8 、O 8 8 、8 8 肛m o l L 的H 2 0 2 预刺激细胞后，继而用1 1 0 0 I a x n o l L 的H 2 0 2 攻击，细胞的损伤明显较直接用1 1 0 0 9 m o l L刺激的损伤轻。而且0 ，8 8 1 t m o l L 预刺激后这种效果更为明显，故将O 8 8 m n o l L预刺激细胞2 4 h ，l1 0 0 1 a m o U L 攻击1 h 作为H 2 0 2 诱导M R C 5 适应性反应的模型。乳酸脱氢酶漏出率( L D H ) 的检测：将细胞按对照组、低剂量组、高剂量组、适应性反应组处理后，检测L D H 漏出率，发现对照组和低剂量组L D H 的漏出率差别很小，统计学上没有显著差异( 尸O 0 5 ) ；而高剂量组L D H 的漏出率和对照组比较，显著增高( p ( 0 0 5 ) ；适应性反应组L D H 的漏出率比高剂量组明显下降，但是还未能够恢复到对照组的水平。A n n e x i nv P I 检测细胞凋亡：同上述处理细胞后检测凋亡，发现：低剂量与对照组比较，活细胞数钥对少些( P 0 0 5 ) ，死细胞数和凋亡细胞数相对多一些( 舢0 5 ) ；而高剂量组和对照组比较，活细胞数明显减少( P O 0 5 ) ；适应性反应组的活细胞数与高剂量组比较有所增多，死细胞数减少，凋亡细胞数略有增多。乳酸脱氢酶漏出率( L D H ) 的检测和A n n e x i n v P I 检测细胞凋亡的结果都验证了通过M T T 法所获得的适应性反应的模型。F A 、T C E 、H Q 的剂量效应美羲瑟适应性反应模型的剂量参照课题组的试验结果。2 荧光差异显示P C R 寻找差异表达的条带以H 2 0 2 、F A 、T C E 、H Q 不同处理组的细胞总R N A 用特定A P s 逆转录的e D N A 为摸板，选择优化的A P s 和A R P $ 组合，进行荧光差异显示P C R ，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过荧光扫描、定位获得差异条带。将低剂量组、高剂量组、适应性反应组与对照组比较：H 2 0 2 有6 0 个差异条带、F A 有6 1 个，T C EI I I低剂量的E C P s 诱导机体适应忡反应差异表达基阙的研究中山大学博j 学位论义有5 2 个，H Q 有3 3 个。3 差异条带的再扩增、克隆、鉴定、测序及同源性比较选择差异比较明显的条带进行二次P C R ，然后通过进一步克隆、测序、同源性比较发现：H 2 0 2 的1 5 个再扩增的条带中，有8 个薪基因，7 个已知基因分别为：核糖体蛋白S 1 5 a ( H o m os a p i e n sr i b o s o m a lp r o t e i nS l S a ) 、凋亡相关转录因子l ( h o m os a p i e n sB C L 2 一a s s o c i a t e dt r a n s c r i p t i o nN c m r1 ，B C L A F I ) 的不同片断、转录起始因子5 ( h o m os a p i e n se u k a r y o t i ct r a n s l a t i o ni n i t i a t i o nf a c t o r3s u b u n i t5 E I F 3 S 5 ) 、N A D H 脱氢酶铁硫蛋白4 ( H o m os a p i e mN A D Hd e h y d r o g e n a s e u b i q u i n o n e 】F e Sp r o t e i n 4 , N A D H c o e n z y m e Qr e d u c t a s e ，N D U F S 4 ) 、核糖体蛋白S 1 0 ( h o m os a p i e n sr i b o s o m a lp r o t e i nS 1 0 ，R P S l 0 ) 、S P G 4 ( h o m os a p i e n ss p a s t i cp 距a p l e 百a 4 ) ；F A 的1 1 个再扩增的条带中，有9 个新基因，2 个己知基因分别为激活T 细胞的核因子5 ( h o m os a p i e n sn u c l e a rf a c t o ro f a c t i v a t e dT - c e l l s5 ，N F A T 5 ) 和三十四肽重复单位3 ( h o m os a p i e n s t e t r a t r i c o p e p t i d er e p e a t d o m a i n3 T P R D 3 ) 。T C E 的1 1 个再扩增的条带中，有2 个新基因，9 个己知基因分别为：N F k B激活澈酶( h o m os a p i e n sN F - k B a c t i v a t i n gk i n a s e ) 、超氧化物歧化酶( h o m os a p i e n ss u p e r o x i d ed i s m u t a s e1 ，S O D l ) 、钾离子通道功能区3 ( h o m os a p i e n sp o t a s s i u mc h a n n e lt e t r a m e r i s a t i o nd o m a i nc o n t a i n i n g3 ，K C T D 3 ) 、H D C M A l 8 P 蛋白( h o m os a p i e n sH D C M A l 8 Pp r o t e i n ，H D C M A l 8 P ) 、溶酶体相关膜蛋白2 ( h o m os a p i e n sl y s o s o m a l a s s o c i a t e dm e m b r a n ep r o t e i n2 ，L A M P 2 ) 、线粒体核糖体蛋白( h o m os a p i e n sm i t o c h o n d r i a lr i b o s o m a lp r o t e i nL 4 7 ，M R P L 4 7 ) 、C G I