第一军医大学博士学位论文LPS模拟肽疫苗诱导保护性免疫应答的研究姓名：罗海波申请学位级别：博士专业：免疫学指导教师：富宁20050609堡主鲎堡垒查L P S 模拟肽疫苗诱导保护性免疫应答的研究博士研究生罗海波指导教师富宁摘要脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h r i d e ，L P S ) 是引起多种感染性疾病的革兰氏阴性( G _ )菌重要的共同致病物质，可导致败血性休克等严重病理变化。鉴于G 菌内毒素血症的高发病率和严重危害，针对L P S 的治疗与预防的研究始终是人们极为关注的课题。目前尚无L P S 或类脂A 拮抗剂用于临床或进入临床观察；而在预防方面，预存抗L P S 抗体与败血症的发生、大样本住院肿瘤患者、烧伤、外科手术等因感染死亡例数呈负相关的现象早已被证实，即对L P S 诱发的病理进程有明确的保护作用，但这种保护力只限于对接种菌或特定血清型的L P S ；而被动输入抗体则有时相限制，即感染前1 小时内应用有效，这显然只适于动物实验。理想的L P S 疫苗应能诱导再次免疫应答，所产生的抗体应是具广谱预防与保护作用。目前L P S 疫苗研制所面临的主要困难包括：L P S 为T I - I ( 非胸腺依赖抗原I ) 型抗原，自然诱导产生的抗体亲和力低、调理杀菌力弱，且无再次抗体应答，亦不能诱导特异性细胞免疫；源于不同种属、不同株乃至不同血清型的L P S 可具不同的抗原性，只能诱导产生与接种菌或L P S 结合的抗体。因而至今尚无批准进入临床实验的具广谱保护作用的L P S 疫苗。针对上述存在的问题，本课题的主要研究思路是：利用噬菌体肽库筛选获得的短肽模拟L P S 的保守性结构表位，将其抗原表位的化学性质由脂多糖改变为短肽，由此使T I 抗原改变为T D 抗原，进而诱导机体内产生有效的再次抗体应答和交叉保护性免疫。本课题组在前期的工作中，从噬菌体肽库中筛选了数十个模拟位克隆，选择三个模拟鼠伤寒杆菌L P S 表位的序列合成短肽，并证明用这三种模拟短肽免疫动物后，可诱发机体产生针对鼠伤寒杆菌L P S 的抗体应答，但由于所获模拟位合成肽的免疫原性较弱，加之当时以B S A 为载体，所产生的抗体效价较低，保护作用亦不明显。据此，本研究着重解决了具交叉保护性抗体的纯化，并以摘要此多克隆抗体为筛选靶分子筛选到了两个系列的环七肽序列：从中选择了一个序列，经修饰设计后进行短肽合成；并以此合成肽1 3 L 与前期所获序列分别交联新型载体一一蓝载体( B c ) 作为实验性疫苗，通过体内外实验鉴定其抗原性、免疫原性及诱导再次抗体应答产生的规律；同时，也观察了该疫苗诱导小鼠的对细菌攻击及内毒素休克的保护作用。本研究包括以下三个部分：一、L P S 交叉保护性模拟位展示肽克隆的筛选1 、制备具交叉反应性的纯化抗L P S 多克隆抗体作为筛选靶分子制各大肠杆菌L P S2 6 3 0 亲和层析柱，自前期研究中制备的具交叉保护性抗鼠伤寒沙门氏菌抗血清中纯化出抗L P S2 6 3 0 多克隆抗体，经试验证实该抗体可与不同种属的L P S 结合，提示不同种属L P S 之间存在共同表位或交叉表位，而我们所纯化的多克隆抗体为交叉反应性抗体。2 、从噬菌体环七肽库中筛选到可模拟L P S 表位的保守序列以纯化的抗大肠杆菌L P S2 6 3 0 多克隆抗体为筛选肽库的靶分子，对噬菌体随机环七肽库进行了三轮筛选后，鉴定出1 2 个阳性克隆，均可与包被及游离纯化多克隆抗体产生较强的结合，经D N A 澳0 序获得了以上1 2 个克隆短肽序列为：c - X X D X X - X c 、c - X - D X X X X X c 、c A S K C T K A c 、c - N N I T R H C c 、c P K Q P F A H c 、c V S P N Q T I - c( 序列正进行专利申请) 。其中7 个克隆经鉴定可与抗鼠伤寒沙门氏菌L P S7 6 2 1 多克隆抗体、抗大肠杆菌多克隆抗体及抗鼠伤寒沙门氏菌L P S 单克隆抗体1 8 6 结合，提示这7 个克隆模拟了鼠伤寒沙门氏菌L P S7 6 2 1 与大肠杆菌L P S2 6 3 0 的共同表位。上述7个克隆短肽均具有近似的- D X X X - 核心序列，提示这一核心序列有可能是模拟L P S 共同表位的优势序列。3 、所获序列以亲水性氮基酸为主，提示模拟L P S 亲水表位对1 2 个阳性噬菌体克隆展示肽的序列分析发现，我们筛选获得的短肽序列中亲水性氨基酸含量的平均值为6 8 ，而前期工作中用抗鼠伤寒沙门氏菌多克隆抗体筛选获得的模拟短肽序列中亲水性氨基酸含量的平均值为2 0 ，提示我们筛选获得的短肽可能模拟L P S 的亲水性抗原表位。二、模拟肽疫苗的制备及抗原性与免疫原性鉴定在前期工作获得多个噬菌体L P S 表位模拟肽序列的基础上，本研究进行了重新设计并合成了四种L P S 表位模拟肽1 3 a ( S A _ C P S W A S F W _ C _ C G G ) 、1 3 b博士学位论文( S A C F Q F Y P A A C _ _ G G ) 、1 2 w ( G P P Q W F F S Q P Q L ) 及1 3 L ( X X C Q E X X X X G C _ X G )( 专利申请中，委托广州市天河庐阳专利事务所，1 个月后可公开序列) ，合成时在原短肽序列两侧各加入两个氨基酸以稳定环七肽构象。由于短肽分子量过低而不具备免疫原性，遂将其与B S A 交联作为体外抗体检测的抗原，与蓝载体( B c ) 交联作为免疫原免疫小鼠与家兔，观察模拟肽与不同抗L P S 的结合，及体内诱导抗体产生的规律。所获结果如下：1 、四种合成肽均具备模拟L P S 表位的抗原性将四种合成肽分别与B S A交联后鉴定其与3 种不同的抗L P S 抗体的结合。实验结果显示，四种合成肽- B S A交联物均可与三种不同的抗L P S 抗体反应，但反应强度不尽相同。其中合成肽1 3 L B S A 与兔抗鼠伤寒沙门氏菌多克隆抗体、兔抗大肠杆菌多克隆抗体及抗鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体单抗1 8 6 结合作用最强；竞争抑制试验结果显示，游离的四种模拟肽对纯化抗L P S 多克隆抗体与包被豹多种属L P S 的结合均有不同程度的阻断作用，其中以1 3 L 短肽的阻断作用为甚。提示四种合成肽均模拟了L P S 表位。2 、四种合成肽B C 交联物可诱导针对不同种属L P S 的再次抗体应答四种合成肽与蓝载体( B C ) 交联免疫B A L B C 小鼠，对免疫后小鼠血清内抗不同种属L P S 抗体效价进行检测，包括鼠伤寒沙门氏菌L P S7 2 6 1 、大肠杆菌L P S2 6 3 0 、大肠杆菌L P S5 0 1 4 ( J 5L P S ) 及L i p i dA 的结合作用，并将之与对模拟肽的反应比较。实验结果证明，合成肽B C 交联物免疫的4 组小鼠体内均有针对鼠伤寒沙门氏菌L P S ( L P S7 2 6 1 ) 、大肠杆菌L P S ( L P S 2 6 3 0 ) 及大肠杆菌L P SJ 5 的抗体产生，且抗体效价随着免疫次数的增加而提高，即小鼠体内产生了针对不同种属L P S 的再次免疫应答。对血清内I g 类别检测显示，1 3 L - B C 免疫小鼠血清内抗体以I g M 、I g G 2 a 及I g G 2 b 为主。上述结果证明作为免疫原的四种合成肽成功地模拟了不同种属L P S 的保守性或交叉性表位，提示通过筛选表位模拟肽的方法，已将L P S 的抗原性质成功地转变为T D 抗原性质，证明了表位模拟这一设计策略运用在制备多糖抗原模拟肽疫苗方面的可行性。3 、四种合成肽- B C 在诱导体内抗体产生中存在表位互补现象在对上述四种合成肽单独鉴定的基础上，本实验还对四种合成肽进行不同组合的免疫效果观察。结果显示不同组合的合成肽- B C 交联物混合免疫小鼠血清内产生的抗L P S抗体效价均较单独合成肽B C 交联物免疫小鼠血清内抗体有明显提高，最佳组合的血清抗体抗L P S 效价达到1 ：1 28 0 0 ，这一结果提示四种合成肽之间可能存在有表位互补的现象。但这种互补所导致的抗体效价增高与对细菌攻击的保护性1 I I摘要关联不明显。具体的表位分析及合成肽功能确定，还需更进一步的研究。4 、灭活鼠伤寒沙门氏菌、灭活大肠杆菌及不同种属L P S 可加强合成肽B C疫苗诱导的抗体应答在本研究中，我们尝试在第四次合成肽疫苗免疫2 周后注射灭活鼠伤寒沙门氏菌，经检测显示灭活菌注射2 周后其血清抗体效价有明显提高，提示给予灭活菌起N - r 特异性加强免疫( B o o s t ) 的作用；同样，在以合成肽1 3 L - B C 为免疫原免疫3 次后的小鼠试验中，给予不同种属L P S 及灭活大肠杆菌进行B o o s t 亦获得了同样的结果；以往对载体效应的描述是：只有相同载体才可诱导再次抗体应答。而灭活鼠伤寒菌、灭活大肠杆菌及不同种属L P S 与合成肽显然不具备相同载体。虽然尚不能解释这一现象的发生机制，但天然抗原可加强合成肽疫苗的反应无疑具有重要的临床意义，这意味着自然感染可加强疫苗反应，并减少疫苗接种次数：同时也为研究其它非蛋白类疫苗提供借鉴。5 、模拟肽1 3 L 可诱导小鼠与家兔对P G N 和L T A 的抗体反应已知P G N ( 肽聚糖) 和L T A ( 磷壁酸) 为革兰氏阳性菌( G + ) 产物，本实验原以此为对照抗原，但意外发现1 3 L 或包括1 3 L 的组合模拟肽免疫所诱导产生的抗体可与P G N 和L T A 反应，相关的机理还需进一步的研究。三、模拟肽疫苗诱导的保护性免痘反应1 、四种合成肽B C 均可诱导小鼠产生对u ) 9 0 致死量鼠伤寒蕾攻击的保护在免疫四次及给予灭活鼠伤寒沙门氏菌攻击后第8 天，以L D g o 致死量鼠伤寒沙门氏菌( O 5 x 1 0 7 l L ) 自小鼠腹腔内注射0 2m U 只攻击免疫小鼠，观察攻击后小鼠存活情况。P B S B C 免疫对照组小鼠在细菌攻击后6 天内死亡( 5 3 i - 0 4 0 天) ，而各合成肽B C 交联物免疫组小鼠存活时间均较对照组有所延长，在单个肽免疫组中，合成肽1 3 L - B C 免疫组小鼠存活时间最长，平均存活时间为1 2 天，最高存活时间达到1 5 天；而四种合成肽组合免疫组小鼠存活时间与单个肽免疫组小鼠存活时间相比均有明显延长，其中以包含1 3 L - B C 交联物混合免疫组的小鼠存活时间延长最为明显，平均存活时间均在1 l 天以上；四种合成肽共同混合免疫组小鼠1 3 a b w L 存活时间平均为1 4 天，且组内有两只小鼠在细菌攻击后未死亡( 3 个月后处死时仍保持高水平抗体滴度) 。提示合成肽- B C 免疫后小鼠体内产生的抗L P S 抗体对遭受细菌攻击的免疫动物具不同程度的保护性作用。2 、模拟肽疫苗可诱导产生对内_ 毒素休克的预防作用本部分研究中我们建立了直接注射L P S 致小鼠内毒素休克的模型，对免疫后经检测确定小鼠体内抗体效价在1 ：16 0 0 以上的小鼠，经尾静脉注射2 0 0t x g 大肠杆菌L P S2 6 3 0 ，经颈I V博士学位论文总动脉插管检测小鼠血压变化。仅免疫载体B C 的对照组小鼠注射L P S2 6 3 0 后初始血压为9 6 8 7 5 7m m H g ，3 0 m i n 时血压下降到8 3 8 + 7 0m m H g ，而后一直呈急速下降至9 0m i n 时血压降为4 5 7 5 1 5m m H g ，然后呈缓慢下降趋势；2 1 0m i n 时血压到达最低值3 2 7 土7 3 5m m H g ，小鼠最终死亡；合成肽免疫组