延边大学硕士学位论文复方丹参注射液对缺氧-再复氧损伤血管内皮细胞的保护作用姓名：朴虎国申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：宋京郁20050429延边大学医学院硕士学位论文复方丹参注射液对缺氧一再复氧损伤血管内皮细胞的保护作用研究生：朴虎国导师；宋京郁教授摘要【目的】探讨复方丹参注射液对缺氧一再复氧损伤的血管内皮细胞的保护作用及其对内皮细胞分泌的一氧化氨( n i t n co x i d e ，N O ) 、总抗氧化能力( t o t a l a n t i o x i d a t i o nc a p a c i t y , T - A O C )及细胞间粘附分子一I ( i n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l e 一1 ，I C A M 1 ) 的影响，从而进一步深入探讨丹参的抗动脉粥样硬化机制。 T Y 法】本实验采用新生儿脐静脉血管内皮细胞( h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l ，H U V E C ) 体外原代培养方法。将血管内皮细胞分为3 组：即正常组：正常血管内皮细胞：缺氧再复氧组：用l m M 连二亚硫酸钠处理后再给于完全M 1 9 9 继续培养1 2h ；丹参组：不同浓度丹参培养1 2h 后再缺氧4 h ，然后加入完全M 1 9 9 继续培养1 2 h 。通过倒景相差显微镜观察和比较，各组内皮细胞在形态上的变化，用免疫细胞化学染色方法检测I C A M 1 在各组内皮细胞中的表达。用M T T 法检测细胞吸光度值，利用分光光度计分别测量细胞上清液中的M D A 、T - A O C 和N O 含量。【结果】免疫细胞化学检测结果则表明I C A M 1 在缺氧一再复氧组的表达非常显著，而正常组和丹参组相似，I C A M 一1 的表达减弱。另外。M T T 比色法结果显示：丹参在( 0 2 5 1 2 5 ) m g m l 浓度范围内对缺氧再复氧后损伤的血官内皮细胞具有保护作用。缺氧一再复氧组的O D 值明显降低，而正常组和丹参组的O D 值则明显增高，在丹参用药浓度为1 2 5 m g m l 时O D 值最高，但其表现浓度依赖关系。正常组( O 4 7 3 O 0 2 ) 、延边大学医学院硕士学位论文f l - 参组( o ，4 0 0 + 0 0 3 ) 与缺氧一喇f l ( o ，1 8 3 O 0 2 ) 作比较的O D 值均有显著差异( P 5 0 为3 分。B ：按每高倍镜视野下大多数细胞染色深度分：深棕黄色为1 分；深褐色为3 分；介于两者之间为2 分。用两项指标的积分及A B 代表各自的表达程度。2 5 M T T 快速比色法分析1 ) 取对数生长期的细胞制备细胞混悬液，细胞浓度为( 1 5 ) 1 05 、m l ：2 ) 接种于9 6 孔培养扳内，每孔加入1 0 0 9 l ；3 ) 试验包括正常对照组、缺氧组，丹参组，每组设8 个平行孔。l O延边人学薮学院硕h 学位论文4 ) 细胞置5 C 0 2 培养箱孵育2 4h ，待细胞贴壁及基本长满时开始做试验。正常组换为无血清的M 1 9 9 培养液1 0 0 9 l 培养1 8h 。缺氧组用P B S 清洗2 次，加入用E a r l e s 液配制的终浓度为I M m 连二亚硫酸钠1 0 0 “1 ，在C 0 2 培养箱孵育4h 后加入完全M 1 9 9 培养液继续培养1 2h 。丹参组加入终浓度为0 2 5 m g m 1 、1 2 5 m g m l 、2 5 m g m l 、1 2 5 m g m l 、的丹参1 0 0 I _ t l 培养1 2 小时后，加入连二亚硫酸钠后孵育4 小时造成缺氧模型后弃去连二亚硫酸钠，用P B S 洗2 次，置c 0 ：培养箱内培养1 2 小时。5 ) M T T 试剂以O 0 1 MP B S ( P H 7 4 ) 配置成5 m g m l 的工作液，现配现用，用O 2 2 “m微孔滤膜过滤除菌。吸弃个孔液体，加入无盘清M 1 9 9 培养基1 0 0 9 l ，再加入5 m g m lM T r工作液2 0 9 l 。混匀，3 7 孵育4h 。6 ) 翻板法弃去孔内培养液，每孔加D M S O ( 二甲基亚砜) 1 0 0 9 l ，用微量振荡器摇震1 0 m i n ，使充分溶解。7 ) 在酶标仪4 9 0 n m 处测量各孔O D 值，以不加细胞孔调零，酶标仪自动打印结果。2 6 生化学检测2 6 1 丙二醛( M D A ) 测定：选用生长良好的H U V E C ，制成细胞悬液。以浓度1X 1 0 5 m l 接种于2 4 孔培养板。每组8 个孔，设置6 个组。先用含2 0 的F B S 的M 1 9 9培养基，培养2 4 h 后换用无血清M 1 9 9 培养基。实验方法同上，然后收集各孔上演波，按照北京邦定生物技术有限公司提供的试剂盒说明，用分光光度计法检测M D A 含量。2 6 2 一氧化氮测定；亚硝酸硝酸掇离子为N O 的稳定代谢产物，已经被证实为指示N O 产生水平的优良指标。分别收集各组细胞培养液，方法同M D A 。测定方法根据南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行操作，用硝酸还原酶法检测N O 含量。2 6 3 总抗氧化能力测定：收集2 4 孔培养板上清液于E P 管中，培养板加入无血清M 1 9 9 培养基I m l 分别置于一2 0 冰箱冷存，待测T - A O C 。测定前取出。细胞处理方法同上。2 7 用E x c e l 软件进行统计学处理。统计学处理所有试验数据均以均值和标准差表示，用t 检验进行统计学分析。延边夫学医学院硕士学位论文结果1 内皮细胞的鉴定：倒置相差显微镜下观察从人脐静脉分离下来的E C 起初是圆形或椭圆形。单个或成团存在；3h 开始贴壁，之后很快生长成为多数单层小角形细胞的集落；培养l 2 臼，细胞生长迅速，集落增大，之后开始融合形成排列疏松的单层细胞，此时细胞较大呈多角形、圆形或椭圆形，l 3 个核仁：3 5 日左右完全融合形成连续的细胞单层。融合后细胞排列紧密，胞体呈多角形，无重叠生长，有接触抑制现象( 图1 ) 。在传代培养时细胞0 5 lh 后即开始附壁生长。另外人的第因子相关抗原的免疫细胞化学检测对鉴定E C 有重要的辅助作用。棕黄色细密颗粒分稚在E C 的胞膜及胞浆中( 图2 ) 。2 内皮细胞形态学观察在倒置相差显微镜下观察，正常组E C 生长旺盛，呈上皮样贴壁生长，细胞呈多角形或长梭形，呈鹅卵石样铺满底层，缺氧一再复氧组E C 缺氧2h 后，细胞间隙增大。胞体变小，细胞收缩变圆，失去细胞间连接，胞浆透明，少数细胞悬浮脱落；随着作用时间进一步延长，胞膜边缘不清楚，部分胞膜不完整，细胞出现空泡和颗粒变性，细胞脱落增多，到将近4h 的时候出现拉网现象。而丹参组的E C 形态上无明显变化，与正常组内皮细胞形态相似。3 细胞化学染色结果缺氧一再复氧组E C 的胞浆和胞膜呈1 C A M 1 ( 图4 ) 强阳性。在正常组( 圈3 ) 中则微量表达，显色轻微或阳性细胞数少。而丹参组( 图5 ) 的E C 染色结果与正常组相似。其结果见表1 。表1I C A M 1 免疫细胞化学染色结果延边大学跃学院碰士学位论文4 。M T T 检测结果丹参对缺氧一再复氧损伤的H U V E C 的作用。用缺氧一再复氧后H U V E C 的O D值( 0 1 8 3 0 0 1 ) 明显下降，与正常组( O 4 7 3 0 0 3 ) 比较P 0 0 1 ，用不同浓度的丹参处理的E CO D 值在1 2 5 m g m l 浓度时最高( 0 4 0 0 4 - 0 0 3 ，图6 ) 。5 各组细胞培养液中M D A 的检测结果E C 经缺氧一再复氧处理后，细胞培养液中的M D A 含量( 5 0 4 2 O 2n m o l m 1 ) 明显升高，而加入丹参的细胞培养液中的M D A 含量 2 3 9 0 + _ 0 1 3n m o l m 1 ) 与正常组( O 0 0 34 - 0 2 2 n m o l m 1 ) 相似，缺氧一再复氧组与正常组和丹参组比较具有显著性差异( P o 0 1 ，图7 ) 。延边_ 大学医学院硕：睢羊位论文复方丹参注射液对缺氧再复氧损伤的H U V E C 释放M D A 的影响 与缺氧再复氧组比较P 0 0 16 一氧化氮含量的比较各组细胞培养液中缺氧一再复氧组的N O 含量( 2 5 6 6 1 3 5 n o l L ) 最低，丹参组的N O 含量( 8 4 0 4 _ + 0 6 8g m o l L ) 与正常组( 9 3 5 6 0 8 1p a n o l L ) 相似，缺氧一再复氧组与正常组、丹参组比较具有显著性差异( P ，o 0 1 ，图8 ) 。7 。细胞培养液中总抗氧化能力的测定E C 经缺氧再复氧处理后，细胞培养液中的T - A O C 为( 2 5 4 3 0 2 3U m 1 )明显升高，而加入月参的细胞培养液中的T - A O C ( 7 6 6 2 _ - - F 0 5U m 1 ) 与正常组( 9 0 0 30 0 0 9 U m 1 ) 相似，缺氧一再复氧组与正常组和丹参组比较有差异( 表2 ) 。4延边大学医学院硕士学位论文表2 个组细胞培养液中T - A O C 含量的比较( i S )+ 与缺氧再复氧组比较P O 0 l5延边人掌医学院颂 学位论文讨论内皮细胞覆盖在血管内膜表面，不仅血液与间质组织间的一层半透性的屏障，而且还具有多种重要的生理功能，参与机体的凝血、免疫、物质转运和生物活性物质释放等过程。正常的内皮功能对于血管壁具有重要的保护作用。血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化及许多疾病的始动环节。引起内皮细胞损伤的因素很多，如细胞因子、活性氧、脂肪酶( L P S ) 等。其中氧化损伤是内皮细胞功能障碍的一种重要原因在心脑血管疾病的发生中起重要作用。内皮细胞损伤后发生的功能改变则是导致心血管疾病( 如高血压、心衰) 发生发展的重要因素1 。“”。引起动脉粥样硬化的因素很多，其中“炎症反应”学说f 1 2 】是最受人们关注的。研究表明n ”体内许多因素可损伤V E C ，以活性氧最重要。活性氧引起的内皮功能障碍是受到人们比较重视的一个问题，也是研究的一个热点问题。活性氧( R e a c t i v eO x y g e nS p e c i e s ，R O S ) 包括过氧化氢、单线态氧、超氧阴离子自由基、羟自由基等。上述活性氯除能使V E C 膜脂质、蛋白质、核酸等氧化破坏外，并可氧化修饰低密度脂蛋白，生成氧化低密度脂蛋白( o x i d i z e dl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n ，O X - - L D L ) ，进而更加促进A S的发展。文献中指出氧化应激以及氧化应激过程中产生大量的活性氧。氧化应激是指机体或细胞内氧自由基的产生与消除失衡，或外源性氧化物质的过量摄入，导致活性氧在体内活细胞内蓄积而引起的细胞毒性过程“”。缺氧一再复氧过程属于氧化应激的过程。近年来众多文献报道羟自由基在缺氧一再复氧损伤中起核心作用1 1 5 1 缺氧一再复氧后产生的活性氧可以透过细胞膜，在膜外与F e 2+ 或C u 2 + 生成羟自由基，从而引发脂质过氧化而导致损伤。大量的活性氧破坏血管内外环境的稳定，引起内皮细胞的功能紊乱，造成血管壁的通透性增加，因而，血浆脂