第25卷第3期 2 0 0 4 年 6 月西 安 交 通 大 学 学 报（ 医 学 版 ） Journal of Xian Jiaotong University （Medical Sciences）7ol8 25 9o8 3 Jun8 2004急性白血病 hTERTmRNA 和 P16 蛋白表达与 端粒酶活性的关系张海涛， 蔡瑞波，王宝燕（西安交通大学第一医院血液内科， 陕西西安 710061）摘要： 目的 探讨端粒酶逆转录酶 （hTERT） 和 P16 蛋白表达与端粒酶活性的关系及其在急性白血病发病过程中的作用。方法 采用 TRAP 和 RT-PCR 法分别检测 40 例急性白血病患者 （白血病组） 及 20 例非白血病且骨髓正常者 （对照组） 的端粒酶活性与 hTERTmRNA 表达； 用免疫组化 SP 法测定 P16 蛋白表达。结果 白血病组端粒酶活性和hTERTmRNA 的阳性率分别为 75% 和 80%， 而对照组均为阴性。白血病组 hTERTmRNA 表达与端粒酶活性呈显著正相关 （r =0. 65， P an teloerase reverse transcri=tase（;:?:）and A16=rotein and t;eir relation Bit; teloerase activity in t;e carcinogenesis of acute leuCeia8Methods :eloerase activityand ;:?:9D Bere detected in 40 =atients Bit; acute leuCeia and 20 noral controls Ey :DA and :FAG，res=ectively；A16 =rotein Bas eined Ey iunocytoc;eical et;od8ResuIts :;e =ositive rates of teloeraseactivity and ;:?:9D Bere 75H and 80H in 40 cases of acute leuCeia，res=ectively，B;ereas neit;er ;:?:9Dnor teloerase activity Bas detected in noral controls8 :;ere Bas a significant correlation EetBeen t;e e9D and teloerase activity（r = 0“ 65，# ia and 95H（19J20）in noral controls（# erase activity（r = - 0“ 81，# 9D andinactivation of =16 ay =lay an i=ortant role in t;e carcinogenesis of acute leuCeia8KEY WORDS：acute leuCeia；teloerase；gene e0. 2 者为端粒酶活性阳性。1. 4 hTERTmRNA 检测 用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取细胞 RNA。采用 RT-PCR 检测 hTERTm-RNA 表达。hTERTmRNA 引物设计， PCR 扩增条件及分析按文献报道6的方法进行。1. 5 P16 蛋白表达的检测 采用 SP 法细胞化学染色。取 106单个核细胞染色， 70% （体积分数） 冷乙醇固定10 min； 涂片经3% （体积分数） H2O2阻断内源性过氧化物酶， 10% （体积分数） 正常羊血清阻断非特异性抗原后， 一抗孵育 2 h， 二抗及三抗分别孵育 30min， DAB 显色， 苏木素复染。用 PBS 代替一抗作阴性对照。以细胞核或细胞浆染成棕黄色为阳性细胞，当阳性细胞 10%定为阳性表达。1.6 统计学处理 采用 x2检验或精确概率法， 以 P0. 05为有显著性差异。2 结 果2.1 端粒酶活性及与 hTERTmRNA 表达的关系 白血病组端粒酶活性和 hTERTmRNA 阳性检出率分别为 75% 和 80%， 而对照组无 1 例检测到端粒酶活性或 hTERTmRNA 表达； 两组端粒酶活性及 hTERTmR-NA 表达率比较， 差异均有显著意义 （P 0. 01） 。此外， 白血病组 hTERTmRNA 表达与端粒酶活性呈显著正相关 （r =0. 65，P 0. 01， 表 1） 。2. 2 P16 蛋白表达及与端粒酶活性的关系 白血病组和对照组 P16 蛋白阳性表达率分别为 35% 和95%， 前者显著低于后者 （P 0. 01） ； 白血病组 P16蛋白与端粒酶活性呈明显负相关 （r = -0. 81， P 0. 01， 表 1） 。表 1 端粒酶活性与 hTERTmRNA 和 P16 蛋白表达的关系Table 1 The relationship between telomerase activity and the ex-pression of hTERTmRNA and P16GroupSample numberTelomerase activityPositiveNegativehTERTmRNA positive32293hTERTmRNA negative817P16 protein positive14410P16 protein negative262603 讨 论正常外周血和骨髓中具有适度端粒酶活性表达的细胞， 可能是某些特定的造血干细胞7 -9。低水平的端粒酶活性既能减缓这类细胞端粒缩短的速度， 使其增生分裂能力有一定程度的增强， 保证了血液细胞充足的自我更新能力， 又不足以使其无限制地分裂增生， 导致恶性肿瘤的发生8， 10。人端粒酶是一种核糖核蛋白复合物， 由端粒酶RNA 成分 （hTR） 、 端粒酶相关蛋白 1 （TP1） 和 hTERT组成。其中 hTR 为端粒酶的主体结构， 包含有编码端粒的模板区及一些附加序列， 但 hTR 并不能激活端粒酶， 或者说 hTR 不能调节端粒酶活性11。TP1的功能是介导端粒酶或其他端粒结合蛋白与端粒结合， 检测端粒酶阳性的肿瘤细胞和端粒酶阴性的正常细胞 TP1mRNA， 未显示有明显差异。表明 TP1 并非端粒酶活性调节的限速因子12。Bodnar 等将 hTERT 基因转染端粒酶阴性的细胞后， 可使细胞重新获得端粒酶活性， 并引起端粒长度增加及细胞寿命延长等一系列改变13， 14。hTERT 是一种特殊的逆转录酶， 可能是端粒酶活性的催化亚单位15。上述资料也支持该基因为端粒酶催化亚单位。本文结果显示， 端粒酶的活性和 hTERTmRNA 白血病组阳性检出率分别为 75% 和 80%， 而对照组中无 1 例检测到端粒酶活性或 hTERTmRNA 表达， 且白血病组 hTERTmRNA 表达与端粒酶活性呈显著正相关。提示 hTERTmRNA 表达上调与急性白血病的发生密切相关， 并可能直接参与急性白血病端粒酶活性调节。p16 基因是一种抑癌基因， 其编码产物 P16 蛋白是细胞周期素依赖激酶 （CDK） 抑制剂， 能与细胞周期素 D1竞争性结合 CDK4而抑制 CDK4活性， 从而阻（下转第 278 页）072西 安 交 通 大 学 学 报（ 医 学 版 ）第 25 卷ated tumor regression by induction of apoptosis J . Science， 1989，245 （4915） ： 301 -304.8 Yonehara S，Ishii A，Yonehara M. A cell-killing monoclonal anti-body（anti-Fas）to a cell surface antigen co-down regulated with re-ceptor of tumor necrosis factorJ . J Exp Med， 1989， 169 （5） ：1747 -1756.9 Frankel B， Longo SL， Ryken TC. Human astrocytomas co-express-ing Fas and Fas ligand also produce TGFbeta2 and Bcl-2J . JNeurooncol， 1999， 44 （3） ： 205 -212.10 Itoh N，Tsujimoto Y，Nagata S. Effect of bcl-2 on Fas antigen-me-diated cell deathJ . J Immunol， 1993， 151 （2） ： 621 -627.11 Subramanian T，Tarodi B，Chinnadurai G. p53 independent apopticand necrotic cell death induced by adenovirus infection：suppressionby E. B19k and Bcl-2 protein J . Cell Growth Differentiation，1995， 6 （2） ： 131 -137.12 Wener M，Malipiero U，Aguzzi A，et al. Protooncogene Bcl-2gene transfer abrogates FasP Apo-1 antibody-mediated apoptosis ofhuman malignant glioma cells and confers resistance to chemothera-peutic drugs and therapeutic irradiationJ . J Clin Invest， 1995， 95（6） ： 2633 -2643.13 Rensing-Ehl A，Frei Q，Flury R，et al. Local FasP APR-1 （CD95）ligand-mediated tumor cell killing in i( J . Eur J Immunol，1995， 25 （8） ： 2253 -2258.14 Frei Q，Ambar B，Adachi N，et al. )* i( malignant glioma cellsare sensitive to Fas （CD95）ligand-mediated apoptosisJ . J Neu-roimmunol， 1998， 87 （1 -2） ： 105 -113.15 Roth W，Fontana A，Trepel M，et al. Immunochemotherapy ofmalignant glioma： synergistic activity of CD95 ligand and chemo-therapeuticsJ . Cancer Immunol Immunother， 1997，44 （1） ： 55 -63.（编辑 邱 芬%）（上接第 270 页）止细胞从 G1期进入 S 期， 抑制 DNA 合成和细胞增殖。若 p16 基因失活不能表达 P16 蛋白时， 使细胞增殖失控而形成肿瘤5。本文结果显示， P16 蛋白在白血病组和对照组阳性表达率有明显差异， 白血病组P16 蛋白表达与端粒酶活性呈显著负相关。表明急性白血病存在 P16 蛋白丢失， p16 基因失活与端粒酶活性密切相关， 可能在急性白血病发病过程中发挥重要作用。但 p16 基因失活是否参与端粒酶活性调节，还有待进一步实验研究