南京农业大学硕士学位论文兰科植物提取物中血管紧张素转换酶抑制剂的研究姓名：谢雅晶申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：张炜20080601英文摘要兰科植物提取物中血管紧张素转换酶抑制剂的研究摘要本文研究了一种兰科( O r c M d a c e a e ) 植物中血管紧张素转换酶抑制剂( A C E I ) 活性有效成分的筛选和提取，利用高效液相层析( H P L C ) 进一步分离纯化了A C E I ，以及A C E I 活性有效成分的体内降压实验。采用硫酸铵沉淀法成功地从兔肺中提取得到高活力的A C E 酶，粗酶液比活力分别为5 1 9U m g ( 以F A P G G 为底物) 、4 9 4U m g ( 以H H L 为底物) 。比较了两种方法测定A C E 活性的特点，以F A P G G 为底物的方法，操作比较简单，成本较低，但易受样品中色素的干扰，以H H L 为底物的方法，操作步骤稍繁琐，但影响因素偏少，特别适合存在色素干扰的样品。以一种兰科植物的花为原料，采用乙醇浸渍法、水浸渍法和两相溶剂萃取法分别提取其中的有效成分，通过测定提取物对血管紧张素转换酶活性的抑制，发现乙醇浸提法提取率较高，且提取物易保存、易回收，故本实验选择乙醇浸提法制备植物提取物浸膏。利用溶剂法对乙醇浸提法所得浸膏分别用水、乙醇和乙酸乙酯进行再_ 次分离，发现利用乙醇浸渍提取后再利用乙醇溶剂分离提取的植物成分具有血管紧张素转换酶抑制活性，半抑制率( I C ) 为1 3 4m g n d 。利用高效液相色谱( 加? L C ，C 1 8 色谱柱) 进行初步分离：流动相采用梯度洗脱，A 相为0 4 的磷酸缓冲液，B 相为甲醇；流速：0 6 m l m i n ；遇峰自动收集。，记录波长在2 2 0 r i m 的色谱图。结果发现在n 5 7 、1 3 0 2 和1 3 3 5 1 n i 洗脱出的极性物质具有体外血管紧张素转换酶抑制剂活性。动物实验选用二肾一夹型( 2 K I C ) 肾血管性高血压大鼠模型，按体重和血压随机分组，分别进行单次给药预实验；单次给药急性降压实验；进行多次给药降压实验。预实验及单次给药急性降压实验结果都表明，给药后2 小时即有降压作用，至1 2小时血压降低仍较明显。单次给药急性降压实验中，中剂量的A C E I 降压作用较强，给药后降压效果都比较明显( 与给药前比较p 。 性0a ；播省图L 3A C E 对血压的谓节作用F i g 1 3E f f e c t s o f A C E 0 1 1r e g u l a t i o n o f b l o o d p r e s s t 此兰科植物提取物中血管紧张素转换酶抑制剂的研究三血管紧张素转换酶抑制剂发展现状大量的研究证实，血管紧张素转换酶抑制剂( A C E I ) 在心血管疾病的治疗中有重要贡献 9 1 ，而且部分A C E I 还可增强机体对胰岛素的敏感性。由于人类许多疾病均与胰岛素抵抗有关，因此未来A C E I 的作用可能要扩大许多倍埔J 。现有抗高血压药物有利尿剂、p 受体阻滞剂、钙通道阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂，血管扩张剂、小受体阻带剂等。其中转换酶抑制剂是应用最普遍的抗高血压药物之一，也是当前被认为最安全、最适合于老年人和有并发症( 如高血压性心脏病并发心功能不全、高血压肾脏损害有蛋白尿) ，伴发病( 如高血压合并糖尿病) 的高血压患者的首选药物之一1A C E I 的分类按其药动学性质主要分三类：( 1 ) 虽以活性形式存在，但需进一步代谢转变为二巯化物才能发挥药理作用；药物原体及二巯化物均经肾脏清除，如卡托普利( 2 ) 前体药物如依那普利、苯那普利、西拉普利、培哚普利、喹那普利及雷米普利，依那普利通过肝脏转变为有活性的依那普利碱，这种二酸型结构经肾脏清除，或被组织摄取后对组织血管紧张素转换酶活性产生抑制。福辛普利有高度脂溶性，其二酸结构被肝细胞摄取后经胆汁排泄，由于该类药物主要在肝脏水解为活性型，故肝脏功能正常与否直接影响到药理作用。该类药物起效慢，但持续时间较长。( 3 ) 无需代谢的水溶性化合物如赖诺普利，不经任何代谢即有活性，在循环中亦不需要同血浆蛋白结合且以原型从肾脏清除，因此其血浆浓度主要与口服剂量、吸收率及肾脏清除率有关。2A C E I 的作用机制在人的生理过程中，血压的调节主要是受到肾素血管紧张素系统和激肽一激肽生成酶系统对拮抗体系相互作用控制的肾素进入血液，将血浆中的血管紧张素原缸p - 垭w T y r - l l e - H i s P r o - P h e H i a - l c u - V a l - T v r - S e r - R水解为血管紧张素I ( A TI ) m l - A m - V a l T y r - l l e H i j s P r o - P h e H i s 1 e u ，在血管紧张素转换酶( a a g i o t e m i nc o n v e r t i n ge l l z y m e ，A C E ) 的作用下，血管紧张素I 转换成血管紧张素( A TI I ) A s p A m l V l l l T y r U e H i s - P r o P h e ，血管紧张素( a n g i o t e m i n ，A n gI T ) 不仅存在于血浆中，也存在于局部组织中【9 】。前者可刺激醛固酮释放，引起钠水储留和钾的丢第一章文献综述失，直接引起外周血管收缩，并刺激交感神经系统；后者可促进体外成纤维细胞有丝分裂，增加平滑肌细胞的蛋白质合成和细胞体积。另一方面激肽激肽释放酶系统也受到A C E 的调控，它可使具有血管舒张作用的缓激肽转变为没有活力的缓释肽，两个系统在A C E 的协同作用下，造成了人体内血压的升高。如果能够抑制A C E 的活性就可以实现降压作用。A C E I 通过阻断A u gI 向A n g I I 转换，阻断了A n g I 的上述作用。除此之外，A C E I 还可有效阻止缓激肽降解，刺激前列腺素、一氧化氮( n i t r i co x i d e ,N O ) 合成，使动脉顺应性增高，从而起到组织保护作用【l o 】。但B a r t h e l e m y 等发现经喹那普利( 1 0m g k g ) 治疗后，心肌缓激肽水平不受影响，因此认为喹那普利对心脏疗效主要是肾素介导的，与缓激肽的降解无关【1 1 1 。3A C E I 的药理学研究3 1 对心脑血管疾病的作用A C E I 对R A A S 的持续抑制可继而改善左心室功能，对心衰者可降低肺毛细血管楔压，降低心脏充盈压，增加每搏输出量，增加左室射血分数和心脏指数【1 2 】，A C E t 还可延缓血管壁和心室壁肥厚，长期应用可减少试验大鼠的心脏重量，减少心肌胶原，预防心脏肥大【l M 4 1 A C E I 显著降低心力衰竭的总死亡率，对轻、中、重度心力衰竭均有良好效果。亚组分析进一步证明A C E I 能延缓心室重塑，防止心室扩大的发展，包括无症状心力衰竭患者。L i u 指出【1 5 1 ，在心衰患者中，A C E I 的益处主要通过N o 介导，在内皮N o 合成酶缺失时，心肌梗死后左室功能不全和心肌重构会更严重，心衰或心肌梗死后A C E I的心脏保护作用会消失。还有学者认为，A C E I 可阻断A n g l l 激活的T 细胞和巨噬细胞释放细胞因子，从而阻断肿瘤坏死因子( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r 。T N F - a ) 、白介素1 ( i n t e rl e n k i n 。I L1 ) 、m - 6 、干扰素等对心肌组织的损伤，还可减弱细胞因子诱导的储存肾素的释放及肾素活性的增加。对于风湿性二尖瓣返流引起的心衰，经A C E I 治疗后，左室舒张末径可明显缩短，其机制为A C E I 具有和心房利钠肽( a t r i a ln a t r i u r e t i cp e p t i d e ,A N P ) 类似的扩血管、利钠、利尿等作用0 6 。实验研究证实卡托普利具有良好的降压作用，并预防肾血管性高血压的大脑基底动脉中膜增厚，减轻间质增生和平滑肌细胞坏死，提示A C E I 具有直接的脑血管保护作用，临床多用于预防高血压性脑卒中旧。在对培哚普利的研究发现，它在降压的同时并不影响脑血流灌注，反而使椎底动脉血流轻微增加，改善脑供血不足，轻度增加脑血流量【1 3 】。既往研究结果表明，高血压能够损害人的智能状态，而抗高血压治疗能兰科植物提取物中血管紧张素转换酶抑制剂的研究够改善患者的智能状态，因此，可用于预防或治疗血管性痴呆【1 9 1 。3 2 对糖尿病的作用A C E I 可增加骨骼肌对胰岛素的敏感性，降低体内胰岛素水平，改善组织能量代谢，促进葡萄糖的利用和降低胰岛素抵抗，使血糖易于控制网】。A C E I 可提高胰岛素敏感性，其可能的机制包括扩张血管，增加骨骼肌血供，从而增加骨骼肌胰岛素受体的敏感性；或由于降低交感神经兴奋性，打破了交感神经兴奋性与胰岛素抵抗间的恶性循环。有关报道认为A C E I 能促进肌肉G L U T 蛋白增加，并能增强已糖激酶活性，使葡萄糖转运增加。雷米普利通过抑制缓激肽的降解，提高循环中缓激肽水平，使血管扩张，提高血管通透性，促进胰岛素介导的葡萄糖摄取和利用，提高胰岛素敏感性【| m 】。运动训练与A C E I 合用促进G L U T - 4 蛋白含量增加及肌肉葡萄糖转运活性增强有叠加作用，说明两种干预通过不同的机制影响葡萄糖转运。S c h e e m 实验研究证实，A C E I 可有效的降低高血压和心衰患者型糖尿病的发生【z 。3 3 对肾病及高血压肾病的作用在多种肾脏疾病的发生和发展过程中，肾素血管紧张素醛固酮系统( R A A S ) 起着关键性作用，它使肾血流量和肾小球滤过率下降，远曲小管钠转运增加，导致水、电解质排泄减少。同时使肾小球膜收缩，使超滤系数下降等。R A S 和肾毛细血管压增高在各种肾脏疾病包括糖尿病肾病所致肾功能不全的发展中发挥重要作用。A C E 抑制剂通过减低动脉压和选择性扩张出球小动脉而降低肾毛细血管压以及拮抗A I I 的作用而发挥保护肾功能的作用A C E I 抑制R A A S 使肾内的A n gI I 水平下降，减轻肾小球和肾小管的损伤，减少自细胞浸润，减轻蛋白尿，增加血清肌配清除率，并且在R N A的水平上阻止转换生长因子、血小板源性生长因子八B 链、胰岛素样生长因子一I 、白介素I 和单核细胞化学吸收剂蛋白I 的增加，从而减轻由于这些细胞因子所致的血管内膜形态和功能的损坏，进而改善肾功能 z 2 J 。实验研究证实A C E I 可减少单核巨噬细胞浸润，抑制间质成纤维细胞活化及减少细胞外基质聚积，改善肾小球硬化和间质纤维化，这一效应与其抑制局部A n gI I 的产生，下调趋化因子骨桥蛋白的表达密切平行相关【2 3 1 。A C E 抑制剂对各种不同肾脏病患者包括肾小球疾病、间质性肾炎、肾硬化症、糖尿病肾病( 多囊肾除外) ，都有保护肾功能的作用，而且A C E 抑制剂的这种保护作用与肾功能不全的严重程度无关研J 1 4第一章文献综述3 4 抗动脉粥样硬化多种疾病( 如高血压病、高脂血症) 和不良饮食习惯( 如吸烟、饮酒) 以不同的机制导致内皮细胞损伤，从而促进动脉粥样硬化的形成。钙拮抗剂和A C E I 干扰细胞内钙超负荷，而A C E I 对动脉粥样硬化的不同阶段均有抑制作用，通过抑制A n g 而发挥抗动脉粥样硬化的作用。A n g1 I 可诱导原癌基因C 1 0 s ，C - m y c 和C j u n 及