抗肿瘤药物实验法安徽医科大学临床药理研究所2010.04.30在抗肿瘤研究中，人们提出了肿瘤多步骤、 DNA突变、细胞凋亡、细胞周期核心机制、细胞周 期启动及多条信号转导途径参与等许多理论和学说 。抗肿瘤药的研究随着理论的更新和技术的进步 ，已从以核酸等为靶点的杀伤型细胞毒药转向对肿 瘤新靶点的研究。包括化学预防药、分化诱导剂、 凋亡诱导剂、信号传导阻滞剂、血管生成抑制剂、 肿瘤耐药逆转剂、生物调节剂以及化放疗保护剂等 。随着新型抗癌药的研究，诞生了许多抗肿瘤药物实 验方法。第1节 肿瘤细胞体外筛选方法一、抗肿瘤药体外方法动物模型在抗肿瘤药物的评价中起重要的 作用，但动物模型费用高，周期长使其不适 合大规模的抗肿瘤药物评价。因此抗肿瘤药 初步筛选首先应采用肿瘤细胞体外实验方法 ，既节约成本又节省时间。1.MTT法【基本原理】活细胞线粒体中存在的脱氢酶能够 代谢还原黄色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2） -2，5-二苯基四氮唑（MTT）为蓝紫色的甲臜； 而死细胞此酶消失，MTT不被还原。用DMSO溶解甲臜后，570nm处酶标仪测定其吸光 度（OD值）。 OD值与活细胞数成正比，因此可 根据OD值推测出活细胞的数目，了解药物抑制 或杀伤肿瘤细胞的能力。 【操作步骤】 （1）0.25%胰酶消化对数生长期细胞，5%10%NBS的RPMI 1640调细胞浓度50000个/ml。96孔板100ul/孔。设溶剂 对照，每组3-6平行孔。37，5%CO2、95%空气的培养 箱中预培养24h，弃上清。 （2）加药物5个10倍稀释的浓度（溶剂常用的有二甲亚砜 和水)，通常为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。 （3）细胞连续培养2472h，每孔加入10l 5mg/ml的 MTT溶液（以无血清培养基配制），继续培养4h。 （4）吸去上清。加入200l DMSO，轻轻振荡以使甲臜完 全溶解。570nm处用酶标仪测定OD值。 （5）计算抑制率(%)=（对照OD-药物OD）/对照OD*100%2.XTT法【基本原理】XTT 是MTT的衍生物，经过 活细胞代谢还原成水溶性的代谢产物， 代谢产物的量与活细胞的数目成正比， 因此利用酶标仪在检测波长465nm处测定 代谢物的OD值可以推测活细胞的数量。 数据处理方法同MTT法。 【操作步骤】 （1）细胞接种，药物处理均同MTT方法。 （2）药物处理2472h后，每孔加50l XTT溶液（内含50g XTT，5l 10mmol/L的电子偶联剂 (PMS)）继续培 养4h。 （3）96孔培养板振荡23min后，直接用 酶标仪在465nm波长处测OD值。【注意事项】 （1）优点：XTT代谢产物溶解于水，不需要吸去 上清就可测OD值，简单方便，减少误差。 （2）XTT不易被线粒体酶还原，因此同时加入电 子偶联剂 (PMS)。 （3）每孔的XTT量不宜加入太多，高浓度的代谢 产物抑制线粒体酶活性。 （4）XTT和PMS现用现配。3.染料排斥法检测药物对肿瘤细胞的生长抑 制【基本原理】活细胞有排斥染料（如伊红、台盼蓝、苯胺黑等 染色的能力，而细胞死亡后由于膜完整性遭到破 坏，细胞即被着色。【操作步骤】 （1）25ml培养瓶中加入细胞4104个、受试药40l， 终体积4ml， （2）5%CO2，37培养4896h。 （3）取细胞悬液0.4ml，加0.4%台盼蓝液0.1ml，在室 温作用5min，在15min内，细胞计数板计数约200个细 胞中死细胞（蓝色）的个数。 【结果评定】 （1）活细胞率%=（未染色细胞数/细胞总数）100%。 （2）将活细胞率与药物浓度的对数作图，可得到S形剂 量反应曲线，计算半数杀伤浓度（LC50）。 （3）当LC5080。阴 性对照组肿瘤为2g左右。(3)试验组动物体重不低于原始体重的20，否则 表示试药剂量过高，需降低剂量重试。1.10.3肌肉接种大鼠Walker癌肉瘤W256模型 【操作步骤】(1) Wistar大鼠，55-65g。后腿肌内接种瘤细胞悬液 0.2ml(约2-4106个瘤细胞),每组用6-10只动物.(2)接种分组给药同前。至第8-11天，处死动物，将 双侧后肢从髓关节处剪下，分别称重，荷瘤肢重 减去正常肢重即为瘤重。 【结果计算】按荷瘤宿主瘤重抑制率公式计算。注意事项(1)本法也适用于S180及EAC等肿瘤。(2)接种用瘤源有两种：一种取用腹水型瘤源，取 传代6-8天的瘤源，抽出的腹水应带有血性；另一 种取用皮下接种的肿瘤以匀浆法制成瘤细胞悬液 。(3)对照组肌肉型平均瘤重为3-5g；皮下型平均瘤 重为3-12g；腹水型平均生存l0-14天。(4)d7给药动物存活率65,否则剂量过大。1.10.4 足趾皮下接种小鼠Lewis肺癌模型 【基本原理】恶性程度较高，受体鼠为C57BL/6， SC、IM接种对药物的敏感性较低，自发转移肺。 接种于后足趾皮下后，待肿瘤生长10d，切除带瘤 足趾称重，计算抑制率。 【操作步骤】取皮下接种8-12d的肿瘤，制成 1107/ml 悬液,足趾皮下接种5105/0.02ml，接种 于C57BL/6,18-24g，6-7Wk。 给药后，次日处死动物，将带瘤后足趾从足关节 处剪下，分别称取荷瘤足趾重，与阴性对照组比 较，计算抑瘤率。 【结果计算】计算肿瘤抑制率.【注意事项】 (1)Lewis肺癌由于其接种的部位不同，可观察抑瘤 率、生命延长率、自发肺转移。 (2)Lewis肺癌对环磷酰胺及亚硝脲敏感，对5-Fu及 博来霉素的敏感性稍差。 (3) Lewis肺癌的足趾接种具有两种意义：一是直 接取荷瘤的足趾测算样本对原发灶的抑瘤率；继 续给药又可观察样本对自发肺转移的效果。 (4)本实验只适用于宿主为近交系的肿瘤模型，因 接种的细胞量偏少，若应用于非近交系动物，肿 瘤的生长将会出现较大的偏差，结果难以统计。 1.10.5 人体肿瘤异种移植于裸鼠的模型【基本原理】裸鼠又称无胸腺小鼠，具有先天性胸 腺缺失；胸腺依赖性免疫功能缺乏，其T细胞功能 接近于零，但B细胞功能基本正常，体内不具排 斥反应，故是人体肿瘤异种移植的理想宿主。异种移植于裸鼠体内的人体肿瘤仍保持其原有的 组织形态及生化功能，以及特有的染色体组型和 对抗肿瘤药原有的敏感性。一般认为人体肿瘤异种移植于裸鼠的模型对抗癌 药的反应与临床有较好的相关性，对临床疗效有 重要的参考价值。【操作步骤】(1)人体肿瘤异种移植于裸鼠的瘤源：一是已建株的人体肿瘤异种移植于裸鼠的模型，腹水 型或实体型，与移植性动物肿瘤模型一样进行操作。二是培养的各种病理类型人体肿瘤细胞。(2) 经一定的潜伏期，可见肿瘤生长。待肿瘤增殖至可 触及时(瘤结节约400mg)，将动物随机分组，进行治 疗。亦可在肿瘤接种后次日即分组治疗。 【结果计算】 (1)计算给药组肿瘤抑制率、生命延长率。 其计算方法同移植性动物肿瘤模型。 (2)裸鼠因皮肤无毛，可便于用卡尺从体外 测量肿瘤的体积，易于动态观察肿瘤的生 长状态，比较治疗组和对照组肿瘤增殖曲 线的变化。每次测量肿瘤的长径(L)和短径 (W)根据下列公式计算肿瘤体积(V)： V=(Lw2)/2。【注意事项】 (1)裸鼠因T细胞免疫缺陷的特性，故对外界的环 境非常敏感，因此裸鼠一定要饲养于无特殊病原 体(SPF)的环境，至少需饲养于层流架内，其饲养 笼需附带有滤膜的盖。所接触和使用的器具、饲 料、饮水、垫料、笼具均预先用高压灭菌处理过 。所用的试药也应无菌处理。实验操作也应在层 流柜内进行。 (2) 价格比较昂贵，实验所需代价高。一般要在 试药通过动物移植性肿瘤有效的基础上再进行本 实验的试验。 (3)异种移植于裸鼠体内的人体肿瘤因仍保持其原 有的肿瘤特性，故其生长周期相对较动物肿瘤模 型为长，因此，有关给药的方案，尤其是给药的 时间和周期因瘤株而异。 1.10.6小鼠肾囊膜下肿瘤移植法 1.10.7抗转移模型的举例 1.10.7.1 Lewis肺癌自发肺转移模型 1.10.7.2 B16小鼠黑色素瘤人工肺转移模型 1.10.7.3小鼠Hep肝癌脾内移植后肝转移模型 1.10.8癌侵袭的动物模型 1.10.8 .1癌骨侵袭大鼠walker-256模型 1.10.8 .2肾侵袭小鼠宫颈癌U14模型 1.10.9原位移植癌动物模型 1.10.9.1小鼠胶质母细胞瘤G422脑原位瘤试验法 1.10.9.2大鼠肝癌BERH一2肝原位移植癌试验法 1.10.9.3人胃癌SGC一7901裸鼠原位接种模型 ， 1.10.10 W256肝内接种介入治疗的模型 1.10.11癌分化诱导的动物模型等。 四、转基因动物肿瘤模型 转基因动物肿瘤模型（Tumor models of transgenic animal）是指通过重组DNA技术将 外源肿瘤基因或相关基因导入动物染色体基因 组，使之稳定表达并能遗传给后代的一类肿瘤 动物模型。转基因方法主要有显微注射法、精 子载体法、电转移、胚胎干细胞移植法、反转 录病毒感染法、人工酵母染色法等多种方法。 用转基因技术构建的肿瘤模型可为肿瘤研究提 供理想的动物模型，为深入研究其发病机制以 及基因药物的等创造了前所未有的条件，为人 类精确地研究基因与疾病的相关关系提供了可 能。但转基因动物肿瘤模型也存在一定的稳定 性，长期繁育传代过程中会发生性状的改变， 甚至丢失。胚胎或精子的冷冻保存技术的应用 可避免这种现象的发生。并在发育和研究中加 强对动物肿瘤生长的生物学特性观察，同时利 用PCR技术检测外源肿瘤基因在动物体内的表 达，以防外源肿瘤基因的丢失。 （一）乙型肝炎病毒（HBV）转基因动物肿瘤 模型 （二）乳腺癌转基因小鼠模型三、体外肿瘤细胞迁移、侵袭能力检测模型 （一）细胞划痕实验（Wound healing assay） 【基本原理】上皮细胞，成纤维细胞，肿瘤细胞等，在生理状态 下，常形成单层或者复层上皮细胞。在病理状态下，细胞迁移的时 候则以侧向运动为主。细胞划痕实验是将细胞单层培养在培养板上 ，待细胞融合后机械性地使小片细胞脱落，然后继续培养细胞，观 察细胞向无细胞的划痕区域迁移情况的实验，很好的模拟了这种侧 向迁移运动，一直被用来检测细胞的迁移能力。 【操作步骤】 （1） 准备：所有能灭菌的器械都要灭菌 ，直尺和Marker笔操作前要在超净台内紫外照 射30min。 （2） 用Marker笔在6孔板背后，用直尺 比着，均匀地划横线，大约每隔0.51cm一道 ，横穿过孔。每孔至少穿过5条线 （3） 向孔中加入约106个细胞，因细胞 增殖能力不同而略有不同，37, 5% CO2孵育 过夜，使细胞贴壁，铺满板底即可。 （4） 第二天，用200l的枪头在细胞表 面进行划痕，枪头应尽量垂直于孔背后的横线 ，可用直尺比着，枪头要垂直。 （5） 用PBS洗涤细胞3次，清除划下的细 胞，然后加入低血清培养液（含1%2%FBS） ，放入孵箱，37, 5% CO2孵育。 （6） 在024h内取不同的时间点拍照， 通过计算划痕区域内无细胞区的面积统计细胞 迁移情况。 【结果判定】比较各组划痕区域内的细胞数目 多少、计算划痕区域内无细胞区的大小或面积 。 【注意事项与模型评价】划痕法的优点：价格 低廉，操作简单，细胞外围环境简单，容易控 制。划痕法的不足：对细胞的要求高，适用的 细胞系范围较窄。划痕实验要求细胞本身具有 较强的迁移能力，且对无血清的培养环境有较 强的忍受力，因此只适用于上皮、纤维样细胞 系和部分肿瘤细胞系。 （二）Transwell （Boyden小室）实验 T