前言日U舌核苷是细胞合成核酸的重要物质。除重新合成途径外，细胞可通过核酸的补救合成途径 即重新利用核酸代谢产物或利用细胞外核苷来合成核酸。核营具有亲水性，细胞外核苷 需借助细胞膜上核苷载体才能进入细胞。 迄今发现的核苷载体分为两大类，即平衡型核菅载体( E q u i l i b r a t i v eN u c l e os id e T r a n s p o r t e r s ，简称E N T s ) 和钠浓度依赖型核苷载体( N a + C o n c e n t F a t iv eD e p e n d e n tN u c le o s i d eT r a n s p o r t e r s ，简称C N T s ) ”“。E N T s 在人类正常细胞膜上分布差异较大”“，组织癌变或经化疗后细胞膜表面的核苷载体数量可异常表达。E N T s 的数量与肿瘤耐药有 关，因此对单个细胞膜上E N T s 的定量有重要意义。 临床常用治疗胰腺癌的核苷类化疗药物如5 一F U 具有亲水性，需借助核苷载体才能进入 细胞。在体内5 一F u 仅少部分被代谢为一磷酸脱氧氟尿嘧啶核苷( F d U M P ) 和三磷酸氟尿嘧啶 核苷( F U T P ) ，前者抑制胸苷酸合成酶的活性而使D N A 合成障碍；后者以伪代谢物的形式掺入 到R N A 中，产生细胞毒性，抻制肿瘤的生长”。增加细胞内5 - F U 的含量将可能增强其化疗效果，胰腺癌预后很差，5 年生存率极低”。虽然化疗是辅助治疗胰腺癌的重要手段，但是胰 腺癌细胞对化疗药物多存在固有或获得性阻抗。据报道。细胞膜表面E N T s 数量与肿瘤耐药 有关”1 ，即认为细胞膜表面E N T s 是转运化疗药物的主要通道。因此确定胰腺癌细胞膜上 E N T s 数量对于阐明胰腺癌产生药物阻抗的机制有重要意义。迄今。已有报道对细胞膜E N T s 进行定性研究，但尚无有效手段对胰腺癌细胞膜尚E N T s 进行定量，潘生丁可与E N T s 以I ： I 结台而阻断其生理功能，并能在一定波长的光波激发下产生荧光。藉此有可能建立一套对 细胞膜E N T s 定性及定量方法。核苷载体抑制剂如潘生丁、地拉唑及其衍生物，可通过阻断相应核苷载体( N T ) 、调节药 物进出细胞过程或干扰核酸合成的补救途径，来增强5 一氟尿嘧啶( 5 - F l u o r o u r a c i l 5 - F U ) 等 核苷类化疗药物的抗癌效果”。抑制有关引起药物向细胞外返流的核瞢载体如E N T s ，可能有提高细胞内药物有效浓度的潜在作用。但完全抑制E N T s 后5 一F u 主要靠浓度型核营载体 ( C N T s ) 转运，此时5 一F u 在细胞内的浓聚过程究竟怎样尚未见报道。 本文研究以胰腺癌细胞株P A N C l 为研究对象，借助潘生丁能与E N T s 共价结合并可被激 发而发荧光的特点，首先对P A N C I 细胞膜上E N T s 在单细胞水平上进行定量研究，再研究用 潘生r 将E N T s 完全阻断后对5 一F u 在胰腺癌细胞内的浓聚过程的影响。东南大学硕士学位论文文献综述核苷载体在细胞水平跨膜转运作用的研究进展作为生命活动的必需物质，核苷不仅与机体的能量代谢和酶的生物活- 眭等有关，而且是细胞台成D N A 和R N A 的原料，并可以调控蛋白质表达与细胞的分裂增殖。恶性肿瘤细胞在细 胞快速增殖时需要摄取大量核苷，以满足合成D N A 和R N A 的需要，利用核苷类衍生物干扰肿 瘤细胞D N A 和R N A 合成，可以达到阻碍癌细胞扩散以治疗癌症的目的。有证据表明，核苷类衍生物分子进入细胞是由细胞膜上的核苷载体所介导，但它对核苷类衍生物的选择性仍未明 了。因此，深入了解核苷类转运蛋白在细胞水平的跨膜转运机制将对合理选择核苷类抗癌药物有重要的指导意义。本文就近年来核苷载体的分布、分类、结构和功能的研究情况做一综述。1核苷载体的分类和分布核苷是亲水性分子，不能自由通过细胞膜的脂质双分子层结构。在核苷进入细胞的不同 途径及方式的研究中，人们发现了核苷载体的存在。1 9 7 2 年，C a ss 等首先报道了人红细胞存在依赖于转运蛋白的核营的非浓度性转运；1 9 8 2 年，K u t t e s c h 等又发现哺乳动物肾上皮 存在另一种可以逆浓度转运核苷的转运蛋白：1 9 8 3 年，B e l t 等发现硝基苄巯基嘌呤核苷( n i t r o b e n z y l m e r c a p t o p u r i n er i b o n u c l e o s i d e tN B M P R ) 可以阻断人红细胞膜上转运蛋白对核营的转运。近年来，人们已能将人类核苷载体各亚型的m R N A 注入爪蟾属的卵母细胞表 达出相应的转运蛋白，这使得有关人类的核苷载体的研究进展迅速。目前，已发现人类细胞膜上存在7 种核苷载体“。依照其对抑制剂的敏感性、对N a 依赖与否和所转运底物的不同分为两大类，即平衡核苷载体( e q u i l i b r a t i v en u c l e o s l d e t r a n s p o r t e r ，E N T ) 和浓度核苷载体( c o n c e n t r a t i v eN u e l e o s i d et r a n s p o r t e rC N T ) 。两种核苷载体对核苷的选择性如表l 所示：表l ：各型核苷载体的天然底物E N T 所介导的是核苷易化扩散，根据N B M P R 抑制转运蛋白的敏感性叉分为两个型：平 衡性N B M P R 敏感型核苷载体( e q u i l i b r a t i v eN B M P R s e n s i t i v en u c l e os i d et r a ns D o r t e r E N T l ，简写es ) 和平衡性N B M P R 耐受型核苷载体( e q u i l i b r a t i v eN B M P R i n s e n s i t iv en u c l e o s i d et r a n s p o r t e rE N T 2 ，简写e i ) 。N B M P R 低浓度( 0 1 n M ) 时即可抑制E N T l 型核苷越佳越运能左! 鎏廛塑! = ! QMM 盟地剑佳田量强：运型且垩盐查王逝查的厶娄细 本文发表于囝外医学、药学分册2 0 0 3 年，第3 0 卷，第一期，1 7 2 2 顶2 -文献综述胞膜和许多肿瘤细胞膜。E N T 2 对N B M P R 不敏感，仅被浓度大于lum o l L 的N B M P R 所抑制，主要分布于骨骼肌细胞，其它细胞则较少表达。E N T 2 不仅与E N T l 一样能转运6 种天然核苷， 还可转运次黄嘌吟。浓度大于l o m oL 几的潘生r 或地拉卓可同时抑制E N T l 和E N T 2 介导的核苷转运。 C N T 系N a + 依赖型核苷载体，介导N a 与核苷的跨膜主动转运。根据其转运底物的不同可分为5 个亚型：l 、C N T I 为嘧啶核苷特异性转运蛋白，主要分布子心、肝、肾、小肠、胰 腺和脑等许多组织的细胞膜，胸苷是其主要底物；2 、C N T 2 是嘌呤核苷特异性转运蛋白，主要分布于胃、空肠、回肠和肾等脏器，鸟苷是其主要底物；C N T I 和C N T 2 亦可转运尿苷和脓 苷；3 、C N T 3 既可转运嘌呤核苷，又可转运嘧啶核苷，主要分布在人脉络丛组织、结场、直肠和向血病细胞；4 、C N T 4 仅对次黄嘌呤核苷不转运，首先在人肾的剧状缘囊泡中发现：j 、 C N T 5 已在人的白血病细胞中发现，鸟苷是其主要底物，还能转运次黄嘌呤核苷、腺苷和_ j 营。C N T 中仅C N T 5 转运核苷的能力可被小于1 0i l m o l L 的N B M P R 所抑制。 正常人类细胞膜上的核苷载体分布差异较大。上皮细胞和部分非极化细胞膜( 如白血病细胞) 既有C N T 又有E N T ，如小肠细胞便有E N T l 、E N T 2 、C N T l 、C N T 24 种转运蛋白：而 其它非极化细胞仅表达E N T ，如红细胞仅有E N T l 一种转运蛋白；当组织发生癌变后，其细胞膜表面的核营载体将发生异常表达；E N T l 在乳腺癌、肝癌和胃癌等肿瘤组织中表达增加， 而在自血病H L 一6 0 细胞中表达却明显F 降：在所有的肿瘤细胞中未见E N T 2 明显表达：C N T l在正常卵巢细胞中较少见，细胞癌变历却表达十分丰富。2 核苷载体的结构和功能2 1E N T 核营载体 人类E N T 中E N T l 和E N T 2 核营i是镶嵌于细胞膜的糖蛋白，由4 5 6 个氮基酸残基组成，分子量为5 0 2 k u ”“1 。它的N二细胞内( 含l3 个氢基酸残基) ，C 端位于细胞外( 含5 个氨基酸残基) 。这两种转运i有5 0 的氨基酸序列相同，并有多个疏水区和亲 水区，由氨基酸的肽段形成1 1 个疏膜n 螺旋( T M ) 。在T M l 2 的细胞外多肽链环， E N T l 和E N T 2 分别有6 6 和8 0 个氨基；组成。其余T M s ，E N T l 和E N T 2 都是由少于l5 个氨基酸残基的短肽链相连。每一个T胞膜内、外测各有4 个亲水肽段，( 如图1 所示) 。 E N T l 和E N T 2 的T M 3 6 即1 0 0 2 5 6个氨基酸残基区间是转运核苷的主要功能 区，也是N B M P R 及潘生丁等阻断剂的主要作用位点。E N T l 上第17 9 位的甘氮酸不仅决定着E N T l 是否有转运核苷的能力，而且也决定着E N T l 对N B M P R 的敏感性。Y a o 等”1 发现鼠E N T l 的第9 9 、17 1 、2 3 1 位的 氨基酸残基是次黄嘌呤转运的芙键部位，圈1人类细胞腆E N T 结构示意圈似乎参与转运通道的组成，但人E N T 2 转运 次黄嘌呤的机制仍不清楚。T M l 2 为E N T l和E N T 2 次要功 能区，若将E N T 2 上第3 3 位的甲硫氨酸变为异柠檬酸( E N T 2 上相应的氨基酸残基) ，则对地拉卓和潘生J 的敏感性将F 降到1 1 0 ，而对N B M P R 的敏感性无变化”1 。其它区域的生理作用尚未确定。 E N T 在细胞膜外有3 个可能的糖基化位点：第一个糖基化位点位丁第4 8 个氦基酸残基即天冬酰胺残基上，若将E N T l 此处天冬酰胺残基置换为其它氨基酸残基，则会导致该糖基化位点缺失，E N T l 对N B M P R 的亲和力也会r 降到l 1 5 ；在E N T 2 第5 7 个肽键上的大冬酰 胺残基为第二个糖基化位点，此处是否糖基化尚不确定；第三个糖基化位点的具体位置尚未东南大学硕士学位论文确定。C h a r l e s 等用经核素标记的核苷检测E N T 的转运能力，结果发现过量的未标记核苷可抑 制标记核苷的转运，细胞内外核苷浓度几乎一致，即E N T 对核苷分子跨膜转运的原动力是胞 膜两侧核苷的浓度筹，其转运动力学特性完全符合M ic h a e l is M e n t e n 方程。因此，E N T 是顺浓度差转运的核苷载体，最终可使细胞内外底物浓度一致。由E N T 所介导的核苷转运过程不仅具有可饱和特点，而且是易化扩散过程，即核苷既可内流入胞又可外流出胞。 E N T l 和E N T 2 的底物为所有天然核苷，且转运速度快、流量高。在正常组织中E N T l和E N T 2 对天然核苷亲和力各不相同。E N T l 对胸苷、腺营、胞苷、鸟：旨的