- 1 -银杏叶总多酚抑菌效果的研究生物科学专业 学生：刘诗琴 指导老师：何丽芳摘摘 要：要：目的探究银杏叶总多酚对供试细菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、伤寒杆菌）的抑菌活性。方法采用滤纸圆片法，测定银杏叶总多酚在不同质量浓度、pH 值、温度下对供试细菌产生抑菌圈的直径大小。结果银杏叶总多酚对供试细菌有较强的抑菌活性，随着银杏叶总多酚质量浓度的增加，其抗菌活性显著增强；银杏叶总多酚对供试细菌的最低抑菌浓度不超过 0.4mg/mL，最佳抑菌浓度为 4mg/mL；在和中性和偏酸性 PH 条件下，抑菌活性较强；银杏叶总多酚溶液具有热稳定性，一定温度范围内处理不影响其抑菌活性。结论银杏叶总多酚具有较强的抑菌活性，可用于食品贮存与加工。关键词：关键词：银杏叶总多酚；供试细菌；抑菌浓度目前国内外抑菌方式主要集中在抑菌药物的研发上，青霉素、链霉素等抗生素类药物使用频繁，然而抗生素的大量使用会引发细菌耐药性、人体过敏反应等一系列不良后果1。因此，寻找一种无毒、高效的抑菌药物有着非常重要的临床意义。植物总多酚是一类广泛存在于各种植物体内的多酚类物质的总称，具有清除体自由基、抗脂质氧化、抗突变、防癌等生物学功能2-4。其中茶多酚、葡萄多酚是研究较多的素材，广泛地应用于食品、医药，精细化工研究等方面5-10。然而对于银杏叶总多酚抑制常见细菌作用效果的研究尚无报道。本研究以银杏叶总多酚作用于供试细菌（大肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌） ，探究银杏叶总多酚的抑菌效果，为银杏叶总多酚的综合利用及开发提供参考依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验仪器BCD-216YHN 冰箱；SZ-93 自动双重水蒸馏器；YX280A 电热手提蒸汽消毒器；WP800TLZ3-K3 微波炉；DHG-90LLOA 型电热恒温鼓风干燥箱；SPX-150BSH-III 生化培养箱；SWCJ-A 洁净工作台；FA2004N 电子天平。 1.1.2 实验试剂牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌水、银杏叶总多酚粉末1.1.3 供试菌种由本系微生物实验室提供：大肠杆菌（Escheriechia coli） 、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 、伤寒杆菌（Typhoid bacacillus） 、枯草芽孢杆菌（Baeillussubtili） 。- 2 -1.2 方法1.2.1 悬菌液的制备吸取 50 mL 已灭菌的生理盐水于分别标有各种供试菌种的三角瓶中，再用接种环挑取少量不同菌种加入到对应的无菌试管中，震荡 10 min，用血球计数板检测，控制菌悬液含菌约 105 cfu/mL，备用（注：以上操作都需在无菌环境下执行，所需的玻璃器材均需 120 高温灭菌 30 min 再烘干。 ）1.2.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定分别将灭菌后的滤纸圆片（直径为 10 mm）置于质量浓度为 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和 1.0 mg/mL 的银杏叶总多酚水溶液中，浸泡 12 h 之后，取出，沥干，备用。向灭菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基分别加入 100 L 的菌悬液，然后再用三角玻璃涂布器涂布均匀。最后将沥干的滤纸圆片分别贴在含菌平板表面，呈三角形。倒置培 48 h 后观察是否出现抑菌圈。重复 2 个平板。以不加银杏叶多酚溶液只加菌悬液为对照。1.2.3 最佳抑菌质量浓度的测定分别将灭菌后的滤纸圆片置于质量浓度为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mg/mL 的银杏叶总多酚水溶液中，浸泡 12h 之后，取出，沥干，备用。向灭菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基分别加入 100 L 的菌悬液，然后再用三角玻璃涂布器涂布均匀。最后将沥干的滤纸圆片分别贴在含菌平板表面，呈三角形。倒置培养 48h 后观察并测量抑菌圈直径大小。重复 2 个平板。将实验结果所得的最佳抑菌浓度设为以下实验中的银杏叶总多酚溶液的质量浓度。1.2.4 pH 值对抑菌活性的影响将灭菌后的滤纸圆片置于用氢氧化钠和盐酸调配成 6 个 pH 值梯度（4- 5、 5- 6、6- 7、7-8、 8-9、 9-10）的银杏叶总多酚溶液中，浸泡 12h 之后，取出，沥干，备用。向灭菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基分别加入 100 L 的菌悬液, 然后再用三角玻璃涂布器涂布均匀。最后将沥干的滤纸圆片分别贴在含菌平板表面，呈三角形。倒置培养 48 h 后观察并测量抑菌圈直径大小。重复 2 个平板。1.2.5 温度对抑菌活性的影响分别取最佳抑菌质量浓度下的银杏叶总多酚溶液 10ml 于 6 支试管中，然后分别在 4、24、50、75、85、100六个温度下处理不同时间,再将灭菌后的滤纸圆片浸泡于各试管中 12h，取出，沥干，贴在含菌平板表面，呈三角形。倒置培养 48 h 后观察并测量抑菌圈直径大小。重复 2 个平板。2 结果与分析2.1 银杏叶总多酚的最低（MIC）和最佳抑菌质量浓度的测定- 3 -对银杏叶总多酚的最低抑菌浓度进行了测定，结果如表 1 所示，伤寒杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌质量浓度为 0.2mg/mL，大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.4mg/mL。表 1 银杏叶总多酚最低抑菌浓度试验结果大肠杆菌伤寒杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌E. coliT. bacacillusB. subtiliS. aureus质量抑菌抑菌圈质量抑菌抑菌圈质量抑菌抑菌圈质量抑菌抑菌圈浓度/效果直径/mm浓度/效果直径/mm浓度/效果直径/mm浓度/效果直径/mm(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation InhibitionMasseffectzoneMasseffectzoneMasseffectzoneMasseffectzoneConcentration diameterConcentration diameterConcentration diameterConcentration diameter1.0+13.61.0+12.81.0+13.41.0+13.40.8+12.40.8+12.40.8+12.40.8+13.80.6+12.20.6+11.80.6+11.80.6+11.40.4+10.80.4+13.60.4+10.80.4+12.60.2-10.00.2+11.20.2+11.40.2+10.80.1-10.00.1-10.00.1-10.00.1-10.0对照-10.0对照-10.0对照-10.0对照-10.0最低抑菌浓度(mg/mL)0.40.20.20.2注：滤纸圆片直径为 10 mm，+为有抑菌活性；为无抑菌活性。最佳抑菌浓度如表 2 所示，在银杏叶总多酚的质量浓度为 3.0mg/mL 时，金黄色葡萄球菌的抑菌圈最大，即为最佳抑菌浓度。大肠杆菌、伤寒杆菌和枯草芽孢杆菌的最佳抑菌浓度为 4.0mg/mL，当银杏叶总多酚质量浓度达到 4.0mg/mL 以上时，抑菌圈的增大幅度较小，考虑到经济成本，选择 4.0mg/mL 银杏叶总多酚做后续抑菌稳定性试验。表 2 不同梯度浓度的银杏叶总多酚抑菌试验结果大肠杆菌伤寒杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌E. coliT. bacacillusB. subtiliS. aureus质量抑菌抑菌圈质量抑菌抑菌圈质量抑菌抑菌圈质量抑菌抑菌圈浓度/效果直径/mm浓度/效果直径/mm浓度/效果直径/mm浓度/效果直径/mm(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation Inhibition(mg/mL) Bacteriostation InhibitionMasseffectzoneMasseffectzoneMasseffectzoneMasseffectzoneConcentration diameterConcentration diameterConcentration diameterConcentration diameter8.0+18.68.0+13.88.0+17.88.0+12.2- 4 -7.0+16.27.0+14.67.0+15.67.0+14.46.0+18.46.0+15.66.0+17.46.0+13.85.0+16.85.0+14.85.0+18.45.0+15.44.0+17.84.0+16.44.0+20.64.0+14.83.0+15.43.0+14.83.0+16.23.0+16.42.0+15.22.0+14.22.0+14.42.0+14.21.0+13.61.0+12.81.0+13.41.0+13.4最佳抑菌浓度(mg/mL)4.04.04.03.02.2 pH 值对银杏叶总多酚抑菌活性的影响图 1.a 可知，银杏叶总多酚在碱性环境条件下对大肠杆菌的抑菌效果比酸性条件下的抑菌效果好，在 pH 值为 7-9 条件下，抑菌效果较强，随着 pH 值得降低，抑菌效果减弱。由图 1.bcd 可知，当 pH 值为中性或弱酸条件下，其对伤寒杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性较高，而当 pH 值为强酸或强碱时，银杏叶总多酚的抑菌活性降低。 图 1 不同 pH 值下银杏叶总多酚对供试细菌的抑菌活性影响2.3 温度对银杏叶总多酚抑菌活性的影响银杏叶总多酚经不同温度处理后对供试菌种的抑菌效果，结果见表 3 所示。经低温长时间放置和高温短时间加热处理后，供试菌的抑菌圈变化不大，但当温度高于 85时，其抑菌活性下降，可能是高温破坏了总多酚结构的缘故，银杏叶总多酚的抑菌活性与其结构密切相关。由此可知，银杏叶总多酚具有较好的常温抑菌活性。c.不同 pH 值下对枯草芽孢杆菌的抑制效 果b.不同 pH 值下对金黄色葡萄球菌的抑制效果a.不同 pH 值下对大肠杆菌的抑制效果d. 不同 pH 值下对伤寒杆菌的抑制效果02468101214161820345678910pH值抑菌圈直径(mm）024681012141618345678910pH值抑菌圈直径（mm）02468101214161820345678910pH值抑菌圈直径（mm）024681012141618345678910pH值抑菌圈直径（mm）- 5 -表 3 不同温度对银杏叶总多酚的抑菌活性的影响抑菌圈直径（mm）温度菌种42d241d502h7530min8510 min1002min大肠杆菌15.616.414.213.413.412.8伤寒杆菌16.415.813.814.214.212.6枯草芽孢杆菌17.217.615.414.812.811.2金换色葡萄球菌 15.415.612.812.613.311.8注：银杏叶总多酚质量浓度为 4.0 mg/mL 3 讨论抑菌试验选取了具有代表性的 2 种革兰阳性菌 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和 2种革兰阴性菌大肠杆菌、伤寒杆菌作为试验材料，研究了银杏叶总多酚的抑菌作用。结果表明银杏叶总多酚具有广谱抑菌作用。金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为是 0.2 mg/mL，大肠杆菌为 0.4mg/mL。伴随银杏叶总多酚溶液的质量浓度增加，抑菌效果明显增强，并显示浓度-效应正相关关系，最佳抑菌浓度为 4.0 mg/mL。pH