基质金属蛋白酶相关基因表达上调涉及原发性肝癌的发生发展南京医科大学第一附属医院( 2 1 0 0 2 9 )刘秀峰施瑞华朱宏王学浩生物芯片上海国家工程研究中心( 2 0 120 3 )郜恒骏南京解放军八一医院( 2 1 0 0 0 2 )刘秀峰秦叔逵肝癌目前是全球死亡率第三位的恶性肿瘤，尤其H C C 在亚洲和非洲发生率很高。近年在欧美国家发病率呈上升趋势。肝癌是目前为数不多的病因比较明确的人类肿瘤之一，一些常见的致病因素如慢性病毒性肝炎、酗酒、代谢紊乱以及其他环境因素，可以导致慢性肝损害和肝硬化的发生，最终发展成肝癌。尽管肝癌的临床研究取得了很大的进步，但其复发率仍然较高。肝癌的复发与它的恶性程度、转移以及血管生成等密切相关。通过一系列肝癌预后分子标志物的研究，可以及早地预测癌细胞的转移，阻L | ! = 肿瘤的生长，判定患者的预后，最终达到满意控制肿瘤的目的。近年来探索H C C 基因表达谱的工作成为热点，为深入阐明其发生发展的分子机制提供了强有力的依据。如p 5 3 、R b 和B 链蛋白基因的突变，c m y c 和c y c l i n D l 的过表达，杂合性丢失( L O H )以及T G F - a 和D 等研究反复被报道。但目前这些分散的报道不能给出H C C 分子机制的清晰全貌。本研究应用A g i l e n t 公司研制的寡核苷酸芯片( 2 1 ，0 7 4 点阵) 商通量比较原发性肝癌和癌旁组织以及肝癌和正常肝组织的D E G s ，筛选相关基因进行荧光实时R T - P C R 验证，鉴定与H C C发生发展相关的新基因，为阐明疾病进展的分子机制提供依据，为临床治疗提供新的靶点。材料和方法1 患者一般资料：1 0 对标本来自南京医科大学第一附属医院肝移植中心和南京解放军八一医院全军肿瘤中心肿瘤外科的住院患者，均有“乙肝”和肝硬化病史，年龄范围为3 5 6 0 岁。其中男性4 例，女性2 例，肝功能C h i l d p u g h B 级2 例，C 级4 例。T N M ( 按A J C C l 9 9 7 年标准)期1 例，m 期3 例，期2 例。均施行正位肝移植( o r t h o p h o f i a l i v e r t r a n s p l a t a t i o n ，O L T ) 手术。收集患者癌组织、癌旁组织以及远离肿瘤的正常肝组织，之前获得家属的知情同意以及医院I 临床研究委员会的批准。组织切除后立刻储存于液氮，实验时移入_ 7 0 。C 冰箱。标本大小约1 c m 3 ，肿瘤样本应避免坏死组织，癌旁组织从同一肿块旁2 c m 处获取，正常肝组织远离肿块5 c m 以上或另一叶无肿瘤的肝组织中获取。所有组织样本的病理特征均经常规H & E 染色证实。2 总R N A 抽提( T r i z o l 法) ：取l O O m g 的H C C 、P C T 和N L T 组织分别加入1 m l T f i z o l ，匀 浆器充分打碎组织块，加入1 ，5 体积的氯仿，混匀静置5m i n 后于4 “ C 、1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，取上清液转入1 5 m l 离心管，加入等体积的异丙醇，7 ，5 0 0 m m 离心2 0 m i n 后弃上清，向沉淀中加入2 5 体积的7 0 乙醇，7 ，5 0 0 c p m 离心2 0 m i n 后弃上清，沉淀室温晾干后加入适量无R N A 酶的水充分溶解沉淀，测定各组R N A 样本的O D 2 6 0 和O D 2 值。3 总R N A 质量检测和纯化：采用L a b o n - c h i p 检测总R N A 的质量。具体实验步骤按A g i l e n t2 1 0 0 分析仪的操作说明，按软件提示进行R N A 电泳操作。4 c R N A 合成、荧光标记、纯化：各组样本分别取4 0 0 n gR N A 于1 5 m l 离心管中，加入T 7 启动子引物1 2 “1 和无R N A 酶的水，总体积为I I 5 ul ，6 5 保温1 0 m i n ，冰浴5 m i n 。5 第一链缓冲液在使用之前于6 5 “ C 保温3 4 r a i n ，并震荡混匀后离心。然后配置c R N A 合成体系：5 第一链缓冲液4 u l 、0 1 M D T T 2 u 1 、1 0 n M d N T P 混合物1 u 1 、M M L V R T lu 1 和R N a s e O U T 0 5p l ，总体积为8 5 1 , 1 1 。然后将上述混合物加入变性后冰浴的R N A 中混匀，4 0 “ C 保温2 h 。c R N A 合成结束后将离心管置于6 5 。C 保温1 5 r a i n ，加入2 4ul C y 3 C y 5 荧光混匀。配置转录混合物：无R N A 酶水1 5 3u l 、4 转录缓冲液2 0 u l 、0 1 M D T T6u 1 、N T P8 n l 、5 0 P E G6 4u 1 、R n a s e O U T 0 5u I 、无机焦磷酸酶0 6u l 和T 7 R N A 多聚酶0 8u l ，总体积5 7 6 u 1 。加入上述混合物中，4 0 保温2 h 。荧光探针纯化按Q I A G E NR N e a s y 。M i n iK i t 说明进行。1 8 55 芯片杂交和洗涤：c R N A 的片段化：C y 3 c R N A1ug 、C y 5 c R N A1ug 、1 0 对照靶点5 0ul 和无R N A 酶水共2 4 0ul ，加入片段化缓冲液1 0ul ，轻轻混匀后6 0 保温3 0 r n l n 。加入2 5 0ul 杂交缓冲液轻轻混匀离心。将杂交溶液滴加在盖玻片上，盏上芯片并密封芯片于杂交盒中，6 0 “ C 滚动杂交1 6 h 。芯片洗涤在室温F 进行。配置洗液1 ：双蒸水7 0 0 m l 、2 0 S S P E3 0 0 m l 、2 0 N 十二酰甲基甘氢酸0 2 5 m l ；洗液2 ：双蒸水9 9 7 m i 、2 0 S S P E 3 0 m l 、2 0 N 。十二二酰甲基甘氨酸0 2 5 m i 和洗液3 ：稳定干燥液。取出芯片于洗液l 中洗涤l m i n ，再将芯片放入洗液2 中洗涤l m i n ，是后将芯片放入洗液3 中洗涤3 0 秒。6 芯片数据分析：杂交后芯片通过g g i l e n tS c a n n e r 获取图像，扫描像素值：l 叽m ，P M T ( )数值：1 0 0 ，使用系统的F e a t u r eE x t r a c t i o n 软件进行定量分析。通过对荧光、背景和标准化方式( L i n e a r & L o w e s s ) 等参数的设定，图像定量和数据标准化处理一步完成。输出的数据包括荧光信号、背景信号、标准化后荧光信号与L o g R a t i o 值( 两种荧光c y 3 与c y 5 比值的对数值) 等参数。一般认为R a t i o 值在0 5 2 0 范围内的基因不存在显著的表达差异，而在该范围之外的基因则被认为表达出现显著改变。7 R e a lt i m eR T - P C R 反应( I n v i t r o g e nR T - P C Rk i t ) ：挑选5 倍上调基因M M P - 1 2 为代表，由上海生工生物公司设计合成目的基因引物的正义链和反义链。具体碱基序列如下：M M P 1 2 F ： A C A G r C C T G G T G A T G A T G T G G A ，R ：G C A T A A C C A A G A G T G C A A l _ r G C ：内参照B - a c t i n - F ：G C A G A A G G A A A T C A C A G C C C T ，R ：G C T G A T C C A C A T C T G C T G G A A 。从，8 0 “ C 冰箱中取出R N A ，在室温下解冻，然后在0 2m lP C R 管中配制反应溶液：总R N A 5ug 、O l i g o - d T ( 1 5 ) ( 1 0 0 0 1 x g p 1 ) 0 5 1 x l 、d N T P 混合物( 1 0 m M ) 1 H I 和双蒸水，总体积为1 2 。将反应管置于P C R 仪中，6 5 预变性5 m i n 。变性反应结束后在P C R 管中配制c R N A 第一链合成反应体系：5 第一链缓冲液4 呲i 、0 1 M D T T2 0 , t l 、R N A 抑制子1 0p , l 和S u p e r s c r i p t ( 2 0 0 U i J 1 ) 1 o g l ，总体积2 0 “I ，将P C R 管置于P C R 仪中进行反应，4 2 保温5 0 m i n 后，7 0 变性1 5 m i n ，4 一。反应体系：2 缓冲液1 2 5u 1 、5 0 X P o x 0 5 9 l 、引物( 5 p m 0 1 ) l 山和模板+ 双蒸水1 1 m ，总体积2 5 l ，5 0 2 m i n ，9 5 1 0 m i n ，进行4 5 个循环，9 5 1 5 秒，6 0 I r m a 。先得到相关基因的C t ( 待测基因c t 一管家基因C t ) ，再转换为原始模扳浓度- - 2 - a C t , 应用A B IP r i s m7 0 0 0S D S软件对原始数据进行分析。 结果1 R N A 质量检测：L a b - o n c h i p 电泳结果均提示提示正常组织、癌旁组织以及肝癌组织的总 R N A 的质量和纯度高，无降解现象( 图1 - 3 ，略) 。2 芯片杂交结果：芯片结果采用A g i 。l e n t 扫描仪进行扫描，差异基因筛选标准为r a t i o 或= 2为上调基因，r a t i o 或= o 5 为下调基因。重复点变异系数平均值( C V 值，) 为6 6 4 ，实验体系稳定，荧光信号强度强且均一，重复点C V 值变化小( 如图4 6 所示，略) 。在2 倍D E G s 中，上调基因共4 2 0 个，下调基因共5 5 2 个，全面涉及细胞周期相关基因、信号转导相关基因、肿瘤转移相关基因、凋亡抑制基因、抑癌基因、细胞骨架蛋白以及粘附分子等。A g i l e n t 芯片几乎涵盖了与M M P s 相关的所有基因，在2 5 个被扫描的基因中，未发现M M P s 的 下调表达，而上调基因中，只有M M P - 9 、一1 1 和1 2 出现上调表达，且M M P 1 2 出现了几乎1 0倍以上的上调。3 个基因均随着恶性程度的升高表达增加。详细扫描结果见表1 。3R e a lt i m eR T - P C R 结果：以B a c t i n 为内对照，检测目的基囡 o 口一1 2 在癌、癌旁和正常肝组织中的扩增，B - a c t i n 在相应组织中的c t 值为1 9 2 6 、2 1 7 9 和1 9 0 8 ，目的基因M M P - 1 2 在相戍组织中的扩增情况祥见表2 以及图7 、8 ( 略) 所示。结果提示，M M P 1 2 在癌组织中的扩增明显高于癌旁和正常肝组织结果与A g i l e n t 芯片杂交结果一致。壅! 垒臣堡坐蔓丛生皇竺塑羞茎固塑塑堂笪星S y m b o lR a t i o ( C y 3 G y 5 ) R a t i o ( C y 3 C y 5 ) G e n B a n k _