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Evaluation of the genetic diversity of avian paramyxovirus type 4禽副粘病毒4型基 因多样性的评估Introduction n副粘病毒科病毒已经在世界各地的禽类、 水生和陆生动物中分离出来,而大部分副 粘病毒是从禽类中分离出来的副粘病毒亚 科禽腮腺炎属病毒,因此称之为禽副粘病 毒(APMVs)。nAPMVs分为9个血清型,APMV-1到APMV-9 ,最近APMV-10和APMV-11这两种血清型 分别被发现。Introduction nAPMV-1包含所有NDV的株型,它可以感染 240种鸟类,宿主范围非常广泛。nAPMV-2,-3和-7可以感染鸡和火鸡等笼养 鸟和驯养家禽。nAPMV-4,-6,-8和-9只能感染鸭和鹅等水禽nAPMV-5大多从鹦鹉分离出来,也可以从野 鸟中分离出Introduction nAPMV疾病发生有相当的差异。nAPMV-1(NDV)的临床表现可以从亚临床 表现到严重的表现,从而造成鸡的高死亡 率nAPMV-2可以造成轻微的呼吸疾病和降低产 蛋率,还可以使火鸡不育nAPMV-3与脑炎有关并造成笼养鸡的高死亡 率,还可造成火鸡的呼吸疾病和小鸡发育 不良Introduction nAPMV-4可以造成鸡的肺炎和卡他性气管炎nAPMV-5能使未发育完全的鹦鹉抑郁、呼吸 困难、腹泻、斜颈和严重致命的肠炎,造 成高死亡率nAPMV-6使火鸡出现呼吸疾病并降低产蛋率 ,但对于鸡无致病性nAPMV-7使火鸡出现呼吸疾病和气囊炎,并 降低其产蛋率nAPMV-8和-9不造成任何疾病Introduction nAPMV是一种单股、负链、不分段的RNA病毒, 序列长度范围从14904nt到17262nt,可转录6个 mRNA,进而编码6种蛋白,分别为核衣壳蛋白 (nueleocapsid protein,N)、磷酸化蛋白 (phosphoprotein,P)、基质蛋白(martix protein,M) 、融合蛋白(fusionprotein,F)、血凝素一神经氨酸 酶蛋白(haemagglutininneuraminidase,HN)和大聚 合酶蛋白(largeprotein,L)nAPMV-6还有一个额外的第七个mMRNA,编码一 个小的疏水蛋白(SH)nP基因还含有2个编码非结构蛋白的基因,分别是 W蛋白和 V蛋白Introduction nAPMV基因顺序为3-N-P-M-F-(SH)-HN-L n病毒转录开始于3端单独的启动子,其复制 是由起始子(GS)和终止子(GE)介导的 开始-终止-再开始的循环过程nAPMVs基因核苷酸长度是6的偶数倍,是为 了有效地RNA复制和多核苷酸在核衣壳的 包装Introduction nAPMV-1的全基因序列及其抗原和序列的多样性已 经被收录n根据F基因的序列,NDV被分为两大类(和 )。类进一步分为15个基因型,包括已经确定 的基因型(到和 ),还有5种新的基因型 (, ,XIII, XIV 和XV )n而我们所知的APMV-2到-9的抗原和基因多样性是 非常有限的。APMV-2全基因序列和局部HN序列 的分析显示其有一些亚群,APMV-3全基因序列和 局部M序列的分析显示其有一些亚群存在,APMV -6序列比较显示其存在亚群,APMV-9局部F和HN 基因序列进化分析显示其存在亚群Introductionn野生水禽是NDV和禽流感的容器,同时通过不表 现临床症状来保存病毒。这可以促进对家禽以及 水生和陆生野禽监测项目的发展nAPMV-4经常从各地监测项目中的健康水禽中分离 出来n但是其基因分析从没被报道过nAPMV-4原型(鸭/香港/D3/75)基因全长测序, 还有韩国野鸭和比利时野鸭的APMV-4基因全长测 序,最近还对埃及鹅的APMV-4基因全长测序n比较香港和韩国的基因全长显示其基因多样性是 稳定的,推测其有抗原亚群Introductionn为了进一步了解APMV-4的基因多样性,对 P,M,F和HN基因测序,用5组意大利鸭分离 出的APMV-4进行试验,并与公布的香港、 韩国和比利时的APMV-4序列进行比较n同时研究抗原多样性所到达的程度Materials and methodsn病毒和细胞nAPMV-4分别为意大利鸭3670/06(IT-3670) 意大利 野鸭3936-70/06(IT-3936) 意大利短颈野鸭4103- 27/06(IT-4103) 意大利野鸭4284-20/06(IT-4284) 意大利野鸭4523-4/(IT-4523) 香港鸭D3/75( HK)(国际兽医实验局)n用9日龄SPF鸡胚培养,免疫4天后收集感染的尿囊液,并 测定各自的效价n美国标准菌库提供鸡胚成纤维细胞细胞系,在含10%牛胎 血清的细胞培养基中培养。用效价为28血凝单位的100倍稀 释病毒液感染该细胞(含或不含1ug/ml胰蛋白酶的无血清 细胞培养基),连续7天观察细胞病变效应以及细胞培养 液上清的血凝活性Materials and methodsnP,M,F和HN基因测序n不连续蔗糖梯度离心分离病毒n试剂盒提取RNA(QIAGEN, USA )ncDNA合成:RNA提取液, 逆转录试剂盒(Invitrogen ) ,随机引物或APMV-4引物(5-CTAGGGTGGGGAAGG- 3)nPCR扩增:1.F和HN扩增 引物 p4247 (5-CACTGATCACTGGAAATGTAA-3) p4365 (5-TCACACCTCCCCGCCACGAAA-3) p5490 反转录 (5-CCCCACTGAGACACTTGACTAACT-3) p5340 (5-TCAATAGGGATGGTGGACTTTA-3) p6239 (5-GTGCATGGTAGGGTGGGGAAGGTA-3) p6390 反转录 (5-ACTTCTGTTGACTTCTCTTGGTA-3) p6291 (5-ACCAAGAGAAGTCAACAGAAGTAT-3) p8223 反转录 (5-ACGTGGGTGCGAGTCAAGGAACAA-3) Materials and methodsn2.P和M扩增 引物 p1331 (5-GACGACTTCCCACTGTCGGGATCCATGCCGGCTCTCTC-3) p2005 反转录 (5-TTGGGCCTCTTGAGTCTGGCTTTGGCTGC-3) p1875 (5-GATCATCAGGCCAACGAC-3) p3160 反转 录 (5-ACAGCAGTTCTTTTTGGTGGGTTGG-3) p3043 (5- GGGCTCCCTCATCTTCAGACACG-3) p4357 反转录 (5- CTTTTGTTTAGACACCCAATCAACT-3)n3.Taq酶(Invitrogen)n琼脂糖凝胶电泳n直接测序或复制到拓扑异构酶载体(BDT测序试 剂盒)Materials and methodsn序列对比和进化分析 the SeqMan and EditSeq programs of the Lasergene 8 (DNASTAR) clustalW multiple alignment algorithms of MagAlign program of DNASTAR the basic length alignment search tool (BLAST) the Kimura-2 parameter in the MEGA version 4.0 program n数据库收录号n意大利分离的APMV-4免疫鸡 共7组,每组3只2周龄 SPF鸡,香港组,意大利5组,对照组,免疫当天和21天收集血清n血清学分析 HI试验(同源) 交叉HI试验(异源) 进行统 计分析Results n意大利株体外生长特点 n意大利株在9日龄鸡胚和鸡胚成纤维细胞DF-1细胞系上培 养的复制特点与以前得到的香港株、韩国株和比利时株相 似n在鸡胚高效复制,免疫后4天尿囊液的效价高达29 HA单位 ,而在DF-1细胞几乎不感染,产生的最大效价是24 HA单 位n在培养中外源蛋白酶并不影响病毒复制Results n局部基因序列的测定n香港株、韩国株和比利时株的全基因序列已经测定n本实验中,测定了意大利株局部基因序列N基因末端到L基因始端, 测定这个范围的基本原理:M,F和HN是内部相关蛋白,而P是多变的 内部蛋白n全长6598nt,占全基因的44%,与所有APMV-4株相同n香港株始端信号是13nt(3-UCCCACCCCUUCC-5),其中有3和1nt分 别与基因的N和F不同(UCCACACCCUUCC 和 UCCCACCCCUUCA) ,其他株型的P,M,F和HN基因序列均相同n香港株末端信号是12nt(3-AAAUUAAUUUUU-5),其中有2,1和1nt 分别在P,M和L基因不同(AAAAUAAGUUUU, AGAUUAAUUUUU, AAAUUAUUUUUU)nM基因末端信号不同:意大利株和比利时株UUAGUUAAUCGUUU, 香港株UAGUUAAGUUUUUU,韩国株UUCGUCAAUCGUUUResults nP基因n意大利株长度为1364nt,编码33aa的P蛋白,这与香港株和 韩国株和比利时株相同,有10个丝氨酸,6个苏氨酸和一 个络氨酸残基是潜在的磷酸化位点n意大利株之间P基因核苷酸与转录的氨基酸一致性达97.2- 100%和97.5-100%,与韩国株一致性达97.5-98.2%和96.6- 98%,与比利时株一致性达96.6-98.8%和96.2-98.7%,与香 港株一致性达89.2-90%和92.1-93.1%nP基因442-450nt位置有相同编辑位点5-AAAGGGGGG-3, 在这里有一个非模板的甘氨酸残基,可以产生V蛋白(其 氨基酸序列与韩国株和比利时株一致性比与香港株的高)Results nM基因n意大利株长度1293nt,编码370aa的M蛋白(意大利株、韩 国株和比利时株),香港株编码369aa的M蛋白(3端未翻 译区)n其核苷酸和氨基酸序列一致性同样很高nF基因n1891nt,566aa,其序列特点是蛋白裂解位点(DIPQRF)、 糖基化位点、半胱氨酸和七肽重复区,然而N端
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