中山大学博士后学位论文SARS患者免疫功能分析及SARS疫苗研制姓名：黄嘉凌申请学位级别：博士后专业：基础医学病理生理学指导教师：黄文林;冼励坚20041101中山大学博+ 后站撤告S A R S 患者免疫功能分析及S A R S 疫苗研制s e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m ec o o n a v i r u ss e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e - a s s o c i a t e dc o r o n a v i r u ss p i k ep r o t e i nm e m b r a n ep r o t e i ne n v e l o p ep r o t e i nn u c l e o c a p s i dp r o t e i nh e m a g g l u t i n i ne s t e r a s ec h i c k e ne m b r y of i b r o b l a s to p e nr e a d i n gf r a m en o n t r a n s l a t e dr e g i o n sm o d i f i e dv a c c i n i av i r u sA n k a r ap r e d i c t e du n k n o v p r o t e i np l a q u ef o r m i n gu n i th e m a g g l u t i n i ne n d o g l y e o s i d a s ep e p t i d eN - g l y e o s i d a s ei n t r a n a s a l l ys u b c u t a n e o u s l ya d e n o v i u st y p e5t i s s u ec u l t u r e5 0 i n f e c t i v ed o s ef e t a lb o v i n es e r u ma m i n oa c i dA g p r e s e n t i n gc e l la n t i g e nb a s ep a i rd e o x y r i b o n u c l e i ca c i dc o m p l e m e n t a r yD N Ar i b o n u c l e i ca c i dn u c l e o t i d eS A R S严重急性呼吸综合征C o V冠状病毒S A R S - C o VS A R S 相关冠状病毒刺突蛋白膜蛋白包膜蛋白核壳蛋白凝血素酯酶鸡胚成纤维细胞开放读码框非编娼厨修饰的A n k a r a 痘病毒未知功能蛋白噬斑形成单位血凝素内糖基化酶肽羧基端糖基化酶鼻内( 经彝)皮下( 经皮)5 型腺病毒组织培养5 0 感染剂量胎牛血清氨基酸抗原提呈细胞抗原碱基对脱氧核糖核酸互b D N A核糖核酸核苷酸。MEN舵呲一一M呻从柏h脯一啪缸娥旭郇眦一眦m中山火学博上后出站报告S A R S 患者免疫功能分析及S A R S 疫苗研制o p t i c a ld e n s i t ye n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nr e v e r s et r a n s c r i p tp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l lp o l y a c r y l a n r i d eg e le l e c t r o p h o r e s i sp e d p h e m lb l o o dl y m p h o c y t ef l u o r e s c e n c e a c t i v a t e de e l ls o r t e ri m m u n o g l o b u l i ni n t e r l e u k i ni n t e r f e t o ni n t e r f e r o nYr e g u l m e do na c t i v a t i o n ，n o r m a l l yTc e l l - e x p r e s s e da n ds e c r e t e dm o n o c y t ec h e m o a t t r a c t a n tp r o t e i n - 1a m i n o t r a n s f e r a s ea s p a r t a t ea m i n o t r a n s f e r a s ec o m p l e m e n tc o n t r o li n t r a m u s c u l a ri n t r a p e r i t o n e a lk i l o b a s em e s s e n g e rR N An u c l e a rf a c t o rKBs t a n d a r dd e v i a t i o na n a l y s i so f v a r i a n c et r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rt u m o rn e c r o s i sf a c t o rt r i s ( 1 1 y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n ea d e n o v i r u ss i n g l e c h a i nv a r i a b l er e g i o nf r a g m e n tO DE L I S AP C RR T P C RP B M Cp A G EP B LF A C SI gI LI F NI F N YR A N T E S光密度酶联免疫分析聚合酶链反应逆转录P C R外周血单核细胞聚丙烯酰胺凝胶电泳外周血淋巴细胞流式细胞仪免疫球蛋白白介素干扰素干扰素y正常T 细胞表达、分泌、受活化调节的化学因子单核细胞化学趋化因子谷丙转氨酶谷草转氨酶补体对照肌肉注射腹腔注射千碱基对信使R N A核因子K B标准差变异分析转化生长因子肿瘤坏死因子三羟甲基氨基甲烷腺病毒单链可变区片段h e a v yc h a i nV I I重链 选坠唑L 一兰堑壁2一脚脚cm曼m协一妨一研哪胁M耋中山大学博k 后出站报告S A R S 患者免疫功能分析及S A R S 疫苗研制a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m e2A C E 2血管紧张素转换酶2f e l i n ei n f e c t i o u sp e r i t o n i t i sv i r u sF I P V猫传染性腹膜炎病毒h e m a g g l u t i n a t i n ge n c e p h a l o m y e l i t i sv i r u sH E V凝血性脑心肌炎病毒i n f e c t i o u sb r o n c h i t i sv i r u sI B V传染性气管炎病毒m o u s eh e p a t i t i sv i r u sM H V小鼠肝炎病毒t r a n s m i s s i b l eg a s t r o e n t e r i t i sc o r o n a v i r u sT G E V传播性胃肠炎病毒a v i a n i n f e c t i o u s b r o n c h i t i s v i r u s1 B V鸟传染性气管炎病毒p o r c i n er e s p i r a t o r yc o r o n a v i r u sP R C o V猪呼吸道冠状病毒p o r c i n ee p i d e m i cd i a r r h e av i r u sP E D V猪流行性腹泻病毒N - t e r m i n a lf r a g m e n to f s p i k eg e n eS N冠突基因羧基端片段r e c o m b i n a n ta d e n o v i r u sc o n t a i n i n gA d s N携带s N 片段的重组腺病毒N - t e r m i n a lf r a g m e n to f s p i k eg e n es p e c i f i cp a t h o g e nf r e eS P F无特异病原体c y t o p a t h i ce f f e c tC P E细胞病变效应 z 塑坐! ! ! ! 塑型! ! 竺! ! ! ! 坚垦堕查竺重复垦3中山凡学博L 岳出站撒告S A R S 患者免疫功能分析及S A R S 疫苗研制S A R S 患者免疫功能分析及S A R S 疫苗研制摘要研究背景严重急性呼吸综合征( s e v e r ea c u t er e s p i r a t o r ys y n d r o m e ，S A R S ) 是由S A R S相关冠状病毒( S A R S a s s o c i a t e dc o r o n a v i r u s ，S A R S C o V ) 引起的多器官、多组织损伤的急性呼吸道传染病。S A R S 具有T 细胞、N K 细胞、巨噬细胞数量减少、活化受抑等免疫损伤特点，综合目前研究结果可以得到免疫器官严重受损、淋巴细胞大量耗竭和免疫缺陷可能是S A R S 患者死亡原因的印象，但S A R S 患者的免疫病理机制迄今仍未清楚，尤其缺乏对患者体液和细胞免疫功能的全貌式、动态研究。另外，鉴于S A R S 的防治尚无有效抗病毒药物，而且S A R S 病程与病人的抗病毒免疫应答过程密切相关，因此，疫苗仍是彻底控制S A R S 的最大希望所在。冠状病毒( c o r o n a v i r u s ，C o V ) 是一个大的R N A 病毒家族，它的宿主非常广泛，包括哺乳动物和鸟类在内的很多脊椎动物都能被感染。冠状病毒是一个六角型的结构，核心为R N A 、核蛋白和膜蛋白，衣壳中含有2 - 3 种蛋白：S 蛋白( sp r o t e i n ，S ) 、E 蛋白( t h es m a l lm e m b r a n ep r o t e i n ，E ) 和红血球凝聚素酯酶( h e m a g g l u t i n i n - e s t e r a s e ，H E ) 。其中S 蛋白是冠状病毒侵染过程中的关键蛋白，也是冠状病毒的主要抗原决定簇。但S A R S - C o Y 的s 蛋白的免疫学特征尚未完全清楚。本研究旨在探讨S A R S C o V 感染后机体的免疫应答规律和可能机制，同时探索5 型重组腺病毒携带S A R S C o VS 基因的亚单位疫苗体内诱导特异I g G 抗体的可行性，并观察该抗体对S A R S C o V 攻击的体外保护作用。 方法( 1 ) 收集9 5 例罹患S A R S 的医护人员的急性期和恢复期血清，用E L I S A方法测定血清细胞因子水平( 白细胞介索2 ，自细胞介素4 ，白细胞介素1 0 ，干扰素Y ，肿瘤坏死因子口