餵飼高脂量飼料時脂肪酸氧化對海鱺免疫狀態的影響餵飼高脂量飼料時脂肪酸氧化對海鱺免疫狀態的影響摘要 現今許多商業水產飼料主要脂質來源，仍以魚油為主，魚油為不飽和脂質， 常溫下為液態，富含高度不飽和脂肪酸，如 DHA 及 EPA。高度不飽和脂肪酸中 有許多雙鍵，易氧化產生醛、酮及過氧化物等分子，對身體具有毒性；而飼料中 DHA 及 EPA 過量 ， 也會降低動物體的免疫力 ； 另由於全世界對魚油需求量增加， 魚油的產量減少，價格變高，因此尋找替代魚油的脂質來源，已成為魚類飼料營 養主要研究課題。本研究將探討使用高脂量飼料時過氧化因子的影響，由魚體的 氧化狀態探討其免疫能力。飼育實驗將以 22%魚油、11%魚油 11%棕櫚油、11% 魚油 11%大豆油、22%氧化魚油及 22%魚油 (添加 Vit E)等五組飼料分別餵食海 鱺幼魚，依時間序列分析魚體隻成長、抗氧化酵素活性及免疫能力。預期餵食 22%魚油之魚體，則由於攝入高量的高度不飽和脂肪酸，脂質過氧化程度也會較 高。餵食氧化魚油組之魚體過氧化程度最高且免疫力較其它組差。 前言 海鱺 ( Rachycentron canadum )俗稱海麗仔 ， 屬於鱸亞目 ， 海鱺科 ， 軍曹魚屬， 是故又稱軍曹魚。海鱺的成魚外型有點像鯊魚 ，在幼魚階段 ，外形和印魚長的 很像 ，喜歡跟著大型的魟魚一同游動 ，一般棲息深度不超過兩百公尺。分布的 範圍除了東太平洋之外 ，他們出現在全世界熱帶和和亞熱帶水域，不耐低溫， 為典型的熱帶性海水魚 (沈，1993)。以螃蟹、魚類和頭足類等海洋生物為食。 在溫暖的季節 ， 會在西大西洋產卵 ； 卵和幼生行浮游生活 。 由於海鱺行獨居生活， 所以捕獲的量較小 ， 少見大量捕獲 。 海鱺經由箱網養殖一年可達上市體型 6 -8 公 斤，養殖後段期間可以使用肥育飼料來增加海鱺的肥滿度，提高魚肉中的油脂， 增加嗜口性。多數魚肉含豐富的蛋白質，當然海鱺也不例外，更可透過養殖過程 中飼料的改善，例如蛋白質的增加以及優質油脂的添加使海鱺魚肉的營養更為提 昇。 飼料中脂質的需求會因魚種類不同而有差異 ， 一般還會受到食性 、 生長階段 、 飼料中醣類和蛋白質含量以及環境溫度的影響，而海水魚脂質需求較淡水魚為高。 一般養殖魚類商業飼料脂質含量在 6%-10%左右，而海鱺達最適生長的脂質含量 在 15%左右 (黃，2000)，較一般養殖魚類高。脂質在魚蝦代謝過程中具有多種 生理功能，是魚蝦類必需的營養物質。脂質是組織細胞的組成成分，各個組織器 官都含有脂肪，脂肪是體內大多數器官和神經組織的防護隔離層，可保護和固定 內臟器官，避免摩擦並能承受一定壓力 (李，1998)。脂肪是飼料中高能量物質， 產生的能量高於蛋白質和醣類，因此可提供主要的能量來源。脂質有助於體內脂 溶性維生素的吸收以及在體內的運輸，維生素 A、D、E、K 等脂溶性維生素僅在脂質存在下才可被吸收及利用。脂質也為魚類提供必須脂肪酸，某些高度不飽 和脂肪酸是魚蝦生長所必須，這些脂肪酸在魚蝦體內不能自行合成，所以必須依 賴飼料中的脂質來提供。脂質的存在，可達到節約蛋白的效果，魚類對於脂肪有 較強的利用能力，因此當飼料中還有適量的脂質時，可以減少蛋白質用於能量的 部分，節約飼料蛋白質用量。 使用高脂飼料來餵食海鱺，其優點有：( 1 ) 飼料中添加適量的高熱量來源， 可以達到節約蛋白質的效果(Protein sparing effects)，由於飼料中蛋白質來源不管 是動物性還是植物性來源，價格均較高，若能添加適當脂質並降低飼料中蛋白質 含量，將可達到節省成本的目的；( 2 ) 高脂飼料中由於脂質的增加，相對的蛋 白質含量減少，脂質產生的能量有效的運用於成長所需，飼料中的蛋白質消化效 率提高，蛋白質蓄積在組織中的效率變高，蛋白質利用率提高，可減少魚體含氮 廢物的排放，維持養殖期間水質的品質；( 3 )以高脂量飼料餵食海鱺的其中一個 最主要的目的 ， 是為了增加海鱺魚肉中脂質的含量 。 提高海鱺魚肉中脂肪的含量 ， 可以增加魚肉吃起來的口感，增加海鱺市場上的價值。 油脂在加熱以及貯存的過程當中，會因種種原因導致油脂氧化，特別是不飽 和脂肪酸，再加工及貯存過程中更容易發生油脂氧化。氧化反應主要是氧化作用 難以在飽和脂肪酸及其酯的分子上發生，而易在不飽和脂肪酸的雙鍵上發生氧化 反應。油脂酸敗大緻分爲三大類：水解酸敗、酮酸酸敗、氧化酸敗。油脂的氧化 過程可分爲三個階段：開始反應 (initiation reactions)、增殖反應 (propagation reactions)和終止反應 (termination reactions)。開始反應：油脂貯存時，在光和微 量元素的作用下，使油脂氧化，生成氫過氧化物再繼續使脂肪酸 産生自由基。此 步驟通常較慢，是脂質氧化反應的決定步驟 (Frankel, 1984)。增殖反應：脂質自 由基會迅速與氧發生反應而形成氧化自由基 (LOO)，過氧化自由基再去攻擊 其他不飽和脂肪酸，產生新的脂質自由基並且形成氫過氧化物聚集，反應形成各 種酸類、醛類、酮類以及其他産物，使油脂産生酸敗的氣味 (Gordon, 1990)。終 止反應：自動氧化的最後階段，油脂已嚴重酸敗，氧化反應生成穩定的分子，達 到相對靜態平衡。氧化脂質之過氧化物也可能再次與氧反應生成 epoxyhydroperoxides, dihydroperoxides或cyclisperoxides等脂質自氧化二級產物。 氫過氧化物也可能會相互結合產升二聚物 (dimmer) 或聚合物 (polymer)，在裂 解成揮發性物質 (Gordon, 1990)。脂質氧化產生之氫過氧化物或分解產物再生物 體中會進一步與蛋白質、細胞膜或酵素作用，影響生物體細胞功能 (Matsushita, 1975)。 由於魚油中含有高度的不飽和脂肪酸，在空氣中容易酸敗氧化，油脂因而變 質。脂質含量高的飼料或者油脂類，在貯藏或加工過程中，因飼料中脂質的過氧 化反應稱自動氧化，而造成過氧化物的蓄積，如果魚蝦食用此種含有氧化油脂的飼料，則所攝食的過氧化物和其分解物會促進體內脂質的過氧化反應。這是因為 過氧化物或者其分解物，在被分解時產生如單項氧氣等的活性氧氣所造成的；另 外過氧化物和其分解物本身也具有毒性 ， 對魚蝦也會造成毒性作用 。 脂質過氧化 ， 特別是多元不飽和脂肪酸 ( PUFA )的氧化，會傷害細胞的生物膜，這是由於細胞 膜上氧化的脂質造成的結果 (Kanazawa, 1991, 1993)。 在魚中，由氧自由基所造 成之活體內脂質過氧化，會導致一些疾病的產生 (Kawatsu, 1969; Watanabe et al., 1970; Murai and Andrews, 1974; Sakai et al., 1989, 1998)。組織的脂質中多元不飽 和脂肪酸含量以及不飽和指標 (unsaturation index) 是脂質過氧化的決定性因子 (Porter et al., 1995)，以海水魚而言，其組織包含大量的 n-3 高度不飽和脂肪酸， 遭受過氧化攻擊及傷害的危險性高 (Sargent et al., 1999)。海水魚類由於不能自行 合成某些高度不飽和脂肪酸 ， 例如 DHA 及 EPA ， 因此必須由飼料及食物中供給， 因此 HUFA 在另一方面而言，是海水魚達最適生長及發育所必須，但是也因為 容易氧化的特性，在過氧化方面有著一定的危險存在。 當有機體體內產生的氧化物超過抗氧化能力時，會產生oxidative stress，所 產生的自由基 (free radical) 會與細胞的蛋白質、核酸及脂質相互作用，因而傷 害組織 。 現今 ， 自由基對細胞成分的傷害被認為是導致人類許多疾病的導致因子 ， 這些疾病如癌症、老化、動脈硬化、關節炎、發炎性腸疾病、神經退化性疾病以 及一些眼睛的病變等疾病 (Halliwell et al., 1994)。脂質氧化會產生許多複雜的副 產物，例如hydroxy及dihydroxy fatty acids、hydroperoxides、volatile aldehydes， alkyl radicals 以及 olefinic radicals等有害物質 (Frankel, 1987) 。攝入氧化脂質會 影響到oxidative stress，因為它們可以透過消化道而吸收 (Staprans et al., 1999) ， 並且併入膜的磷脂質中改變膜的流動性(Hayam, 1994; Staprans et al., 1994)。有研 究指出餵食老鼠氧化的油脂會導致過氧化的組織蛋白 (Hayam et al., 1997)、peroxisome proliferator-activating receptor alpha (PPAR-)產生向上調控的情形 (Chao et al., 2001)且使腸道中異常小囊數目增加，這是癌前的細胞改變 (Yang et al., 1998)。在魚類中，以含有氧化油脂的飼料餵食非洲鯰魚會抑制鯰魚的成長 (Baker and Davis,1996)。 所有的動物體體內均有抵抗氧化的系統，並且維持生物體之健康及避免氧化 誘導的損害產生 (Jcob, 1995)。因此，正常的代謝取決於自由基產生的比率及脂 質過氧化保護因子之活性。這些系統包括各種抗氧化之化合物 (例如維生素E) 以及抗氧化防禦酵素 (Buettner, 1993) 。這些酵素包括自由基清除酵素，例如 catalase及superoxide dismutase (SOD) ，個別作用於hydrogen peroxide (H2O2)及 superoxide (O2-)，而glutathione peroxidase則是清除H2O2及lipid hydroperoxides。其 他的酵素如glutathione reductase則是作用於維持還原態之glutathione的濃度， glutathione-S-transferase則是可以代謝lipid hydroperoxides的isoenzymes。 維生素E是細胞膜的結構成分，且在抗氧化方面扮演重要角色，控制著不飽 和脂肪酸的過氧化，他阻擋自由基在細胞膜上產生鏈反應 (chain reactions) 及 過氧化根 (peroxide radical) (Rucker, 2000)。維生素E能保護組織使其不受氧化破 壞，幫助血小板正常運作，減少血栓發生的可能性。在臨床醫學上維生素E可用 來預防心臟病、癌症、白內障、中風、傳染病以及神經性疾病。研究指出高劑量 的維生素E可以增加老鼠體液免疫及細胞免疫的免疫能力 (Moriguchi, 1990)。此 外，更有研究指出飼料中添加維生素E可以刺激補體及吞噬細胞的功能增強抵抗 疾病之能力 (Pulsford et al., 1995; Montero et al., 1998; Montero et al., 1999; Ortuno et al., 2000) 。 流式細胞儀的原理是當細胞一個接一個的通過 Flow cuvette 時，被雷射光打 到，會產生兩種光訊號：散射光和螢光，其中細胞必須先經可被雷射光激發的染 劑染色之後，才會產生螢光，接著由光偵測器接收訊號，轉為電子訊號，再經由 電子系統處理成為數位訊號，最後由電腦來做資料的分析處理。使用流式細胞儀 來評定細胞活性，是一個敏感度相當高的方法，允許多參數的快速分析。魚類的 免液狀態可由吞嗜性的細胞如嗜中性球、單核球以及巨噬細胞，因特定的 enzymatic cascade 可以產生 reactive oxidants (Clark, 1990) 而表現。在呼吸爆期間， 超氧陰離子、過氧化氫及次氯酸釋放到 phagosomes 及細胞內間隙對於魚體本身 的殺菌能力是相當重要的，在本實驗中所使用的染劑 2,7