联科生物技术有限公司 全国免费电话：800 8571 184 传真：0571-8816 3303 全国免费电话：800 8571 184 联科杭州：0571-8816 3118 联科上海：021-6451 1079 联科北京：010-8219 1878 联科苏州：0512-6866 9926 联科厦门：0592-5597 797 联科广州：020-8350 6317 1Click-iT EdU Alexa Fluor 488 细胞增殖分析试剂盒细胞增殖分析试剂盒 用于流式细胞仪用于流式细胞仪 表表 1 成分成分 材料 含量 浓度 材料 含量 浓度 EdU (试剂 A) 10 mg 非即用 Alexa Fluor? 488 azide (试剂 B) 1 瓶 非即用 二甲亚砜 (DMSO, 试剂 C) 5 mL 非即用 Click-iT 定色剂(试剂 D) 5 mL 4% 多聚甲醛的 PBS溶液 Click-iT 皂素渗透洗涤剂（含0.09 叠氮钠） (Component E) 50 mL 10X Click-iT 含 Triton? X-100的 渗透剂 （试剂F) 5 mL 1X PBS 溶液 Click-iT EdU 反应缓冲液 (试剂 G) 4 mL 10X 溶液，含 Tris 缓冲盐 CuSO4 (试剂 H) 550 L 100 mM Click-iT EdU 缓冲添加剂 (试剂 I) 800 mg 非即用 Click-iT EdU 细胞周期染料， 633/635 nm激发光(试剂 J) 1 瓶 非即用 Click-iT EdU细胞周期染料，488 nm 激发光(试剂 K) 1 瓶 非即用 RNA 酶 A(分子量约 13700, 试剂 L) 260 L 20 mg/mL 贮存条件贮存条件（全试剂盒的贮存条件，每种组分的贮存条件见瓶身） ? 26C ? 干燥 ? 避光 ? 不可冷冻 ? 依说明保存，保质期一年。 可用次数可用次数：依说明用量可用50次 Alexa Fluor? 488 叠氮化物的最大激发/发射波长:Alexa Fluor? 488 叠氮化物的最大激发/发射波长: 495/519 nm; Click-iT EdU 633/635 nm细胞 周期染料激发光：640/658，结合DNA；Click-iT EdU 488 nm细胞周期染料激发光: 546/647, 结合DNA 联科生物技术有限公司 全国免费电话：800 8571 184 传真：0571-8816 3303 全国免费电话：800 8571 184 联科杭州：0571-8816 3118 联科上海：021-6451 1079 联科北京：010-8219 1878 联科苏州：0512-6866 9926 联科厦门：0592-5597 797 联科广州：020-8350 6317 2引言引言 检测细胞的增殖力是评价细胞是否健康、测定基因毒性、评估抗癌药物的基本方法。最准确的是直接 测定DNA的合成，最初通过放射性核苷（如3H胸苷）的结合来完成。这项技术已被抗体检测技术为基础的BrdU（核苷类似物）检测所取代。 本试剂盒是取代了BrdU检测的新方法。其中的EdU是一种胸苷类似物，在DNA的动态合成中掺入DNA。检 测基于一个click反应【14】：铜催化的叠氮和炔的共轭结合。EdU含炔而Alexa Fluor? 488含叠氮化物。普通的流式法可用于检测细胞群中活跃分裂或处于S期的细胞百分数（图1）。 EdU标记的好处在进行实验时显而易见。叠氮染料的小分子特性使得EdU可在温和条件下掺入并被有效 检测，只需醛固定和去垢剂渗透。而BrdU分析则需HCl或DNA酶使DNA变性，暴露出BrdU才能被其抗体结合从 而达到检测的目的。所以，EdU细胞增殖试剂盒易用且与细胞周期染料兼容。本试剂盒可利用小分子有机染 料标记抗体同时检测细胞表面和细胞内标志，如Alexa Fluor? 647（激发/发射光为650/668nm，替代APC）。 藻兰蛋白（APC，RPE），藻胆蛋白的Tandem染料（Alexa Fluor? 610-R-PE）等多种荧光蛋白不推荐与本 试剂盒联用。 本试剂盒包含了标记检测EdU和全血、贴壁或悬浮细胞的细胞周期的所有试剂（图1、3、4）。提供了 两种不同的细胞周期染料，633/635nm激发的红光染料和488 nm激发的蓝光染料与Alexa Fluor 488联用。 按每次0.5 mL的反应用量计算，试剂盒足够50次流式分析。 图1 图1 Click-iT Alexa Fluor? 488叠氮化物和Click-iT 633/635 nm细胞周期染料双参数标记Jurkat细胞。 细胞用10 M EdU处理1小时后检测。 A图Alexa Fluor? 488 azide染色488 nm激发，530/30带通检测。结合EdU的增殖细胞与非增殖细胞可 显著区分；B图Click-iT 633/635 nm细胞周期染料染色的660/20带通检测结果，显示在G0/G1和G2/M期与S 期的不同DNA含量；C图同时测定DNA含量及增殖细胞，双阳性的细胞显示了S期细胞的百分含量。 联科生物技术有限公司 全国免费电话：800 8571 184 传真：0571-8816 3303 全国免费电话：800 8571 184 联科杭州：0571-8816 3118 联科上海：021-6451 1079 联科北京：010-8219 1878 联科苏州：0512-6866 9926 联科厦门：0592-5597 797 联科广州：020-8350 6317 3图2图2 试剂盒流式分析流程图 联科生物技术有限公司 全国免费电话：800 8571 184 传真：0571-8816 3303 全国免费电话：800 8571 184 联科杭州：0571-8816 3118 联科上海：021-6451 1079 联科北京：010-8219 1878 联科苏州：0512-6866 9926 联科厦门：0592-5597 797 联科广州：020-8350 6317 4图3 图3 HeLa细胞经10 M EdU处理2.5小时的Alexa Fluor 488叠氮化物染色结果。488 nm激发530/30带通检测。 结合EdU的增殖细胞与非增殖细胞可显著区分。 图4 图4 Alexa Fluor? 488叠氮化物和Click-iT 488 nm细胞周期染料双参数标记Jurkat细胞。 细胞用10 M EdU 处理1小时后检测。 A图Alexa Fluor? 488叠氮化物染色488 nm激发530/30带通检测。结合EdU的增殖细胞与非增殖细胞可 显著区分；B图同时测定DNA含量及增殖细胞，双阳性的细胞显示了S期细胞的百分含量。 联科生物技术有限公司 全国免费电话：800 8571 184 传真：0571-8816 3303 全国免费电话：800 8571 184 联科杭州：0571-8816 3118 联科上海：021-6451 1079 联科北京：010-8219 1878 联科苏州：0512-6866 9926 联科厦门：0592-5597 797 联科广州：020-8350 6317 5实验准备实验准备 自备试剂：1%BSA的PBS溶液，pH 7.1pH 7.4 去离子水或 18 兆欧纯水 注意事项：试剂J和K是已知或疑似的致突变剂，试剂D包含多聚甲醛，为有害试剂，应采取适当的防护 措施； DMSO有助于有机分子进入组织，包含DMSO的试剂在使用时应测定有害剂量，按当地规定处 理。 试剂E包含叠氮化物，在酸性环境下易产生高毒性的叠氮酸。弃去叠氮化物之前应用流动的 水稀释，以防聚集引起铅爆炸。 试剂准备 以下准备的贮存或工作液并非每个实验都要用到， 本试剂盒包含DNA含量测定和细胞周期区分的 两种染料，测细胞周期时根据现有的激光器选择其中的一种使用。渗透缓冲液也有两种，根据 样品类型和实验的不同使用其中一种。 1.1 试剂瓶打开前置于室温预热。 1.2 制备10 mM EdU溶液：加4 mL DMSO (试剂 C)到试剂A，混匀。剩余试剂20C保存，1年 内稳定可用。EdU也可溶于水溶液中。 1.3 制备the Alexa Fluor? 488 叠氮化物工作液: 加260 L DMSO（试剂C）到试剂B，混匀。 剩余试剂20C保存，1年内稳定可用。 1.4 制备500 mL 1X皂素渗透洗涤试剂：将试剂E全部加入450 mL 1% BSA/PBS，用稀释后的试剂 冲洗试剂瓶使所有浓缩液移出。如只需少量的1X皂素类渗透洗涤试剂，按1：10稀释即可。 稀释液存放于26C，6个月稳定可用。 1.5 制备40 mL 1X Click-iT EdU反应缓冲液：试剂G中的全部溶液加入36 mL去离子水中。用 稀释后的试剂冲洗试剂瓶使所有浓缩液移出。如只需少量的反应缓冲液，按1：10稀释即可。 稀释液存放于26C，6个月稳定可用。 1.6 制备10X the Click-iT EdU缓冲添加剂贮存液： 加4mL去离子水至试剂I， 混合至充分溶解。 用后剩余的贮存液应在20C保存，1年内稳定可用。 1.7 制备Click-iT EdU 633/635 nm 细胞周期染料工作液：加270 L DMSO (试剂 C)至试剂J， 混匀。剩余试剂20C保存，1年内稳定可用。 1.8 制备Click-iT EdU 488 nm 细胞周期染料工作液：加125 L DMSO (试剂 C)至试剂K，混 匀。剩余试剂20C保存，1年内稳定可用。 实验方法实验方法 EdU标记 以下方法针对Jurkat细胞建立，EdU的最佳浓度为10 M，其他类型的细胞都适用。培养基、细胞 浓度、细胞类型和其他因素都可能影响标记。我们建议在最初实验时根据细胞类型和实验条件使 用一定范围浓度的EdU进行优化。如果正在使用BrdU分析细胞增殖，则可使用相似浓度的EdU进行 实验。全血样品的抗凝剂推荐使用肝素。 2.1 为获得最佳的细胞生长条件，采用合适的组织培养液悬浮细胞。与EdU温育之前避免发生 温度改变和洗涤等情况，会减慢结合期间的生长速度。 2.2 在培养液中加入最优浓度的EdU。建议的起始浓度为10 M。温育时间24小时可采用较 低浓度，3045 min则可使用较高浓度。用该培养液的细胞不加EdU设一阴性对照。 2.3 按细胞类型用最佳条件和时间温育。 改变与EdU的作用时间或对细胞进行脉冲标记可计算 出各种DNA合成与增殖的参数。 有效脉冲标记的时间间隔和每次脉冲的时间决定于细胞生 长率。 2.4 收集细胞，进行下一步：细胞固定和（可选）表面抗原的抗体染色。或按3.1-3