浙江大学硕士学位论文丽罱前言近年来，随着手术及体外循环技术的日益成熟，医疗设备的不断更新和完善，使得心外科手术更加安全。但是大量证据证明，心脏手术时由于体外循环( ( C P B )的许多因素可以引起机体复杂的炎性反应，如血液与心肺转流机异物表面接触，缺血再灌注损伤，内毒素的作用等。在C P B 的心脏手术过程中，上述三方面因素同时作用于人体和细胞水平就会导致全身炎症反应。其反应强度和持续时间受下列诸多因素影响，包括( 1 ) 预防性应用抗炎药物；( 2 ) 预充液成分；( 3 ) 搏动性灌注；( 4 ) 机械过滤；( 5 ) 氧合器种类；( 6 ) 体外循环管道材料类型；( 7 ) 体外循环期间温度；( 8 ) 补体激活影响等。体外循环和心脏手术激活产生的全身炎症反应可导致心脏手术后并发症的产生，如呼吸功能衰竭、低心排综合征、神经系统功能紊乱等，最终可导致多脏器功能衰竭，所以在体外循环期间如何防治这些炎性反应的发生已日益引起人们的重视。P M N 是体内重要的非特异性炎症细胞，也是炎症损伤的主要效应细胞，心脏手术期间被激活的P M N 内含有胰蛋白酶E 和髓过氧化物酶的溶酶体颗粒释放入血，并产生氧自由基，损伤肺微循环，导致通气灌流失衡以及心脏手术后内皮细胞的损伤。P M N 与内皮细胞的粘附是发生全身炎症反应必需的先决条件。在C P B中，血液与人工表面的接触可以引起凝血系统、纤溶系统、激肽系统及补体系统的激活，细胞因子的增加，这种体液中的级联反应及循环中的细胞因子，激活P M N ，使其表达整合素( C D l l b C D l 8 ，即为粘附分子C R 3 ) ，触发了内皮细胞白细胞的相互粘附，这是炎症反应的关键环节。粘附第一阶段的特征是循环中白细胞流速由1 0 0 0 1 t r n s 减慢至3 0 1 x m s ，并以非常缓慢速度沿血管壁翻滚；第二阶段由中P M N表面受体上行所调节，主要由内皮细胞粘附分子I C A M 1 和P M N 表面粘附分子C R 3 复合粘附分子介导；粘附的最后阶段涉及P M N 表面受体与内皮细胞配体牢固结合，P M N 穿过内皮细胞屏障并释放弹性纤维酶和髓过氧化氢酶，导致组织损伤。C R 3 属于粘附分子整合素家族中的成员，在炎症反应P M N 与内皮细胞的粘附过程中起到重要的介导作用。以往的研究证实C P B 时P M N 表面C R 3 明显上调：常温T I浙江大学硕上学位论文咖磊时C R 3 在C P B1 5m i n 即开始上升，在C P B 结束3 0m i n 后仍然很高；在低温时，C P B 早期C R 3 上调较常温时有所减少，但C P B3 0m i n 后C R 3 仍有同样明显上调。近几年来，人们开始尝试各种方法来预防C P B 后全身炎症反应，如应用特殊的白细胞滤器，各种炎症介质释放抑制剂，炎性介质受体拮抗剂及免疫调控等。随着对粘附分子在C P B 炎症反应中作用的深入了解，人们对抗粘附分子的作用日益关注。V e r r i e r 等在猴子C P B 模型中应用抗粘附分子单克隆抗体明显改善了心肺功能。因此可以认为，通过对粘附分子参与炎症过程某一环节的干预，如调控细胞表面粘附分子的表达及脱落或通过中和循环中的粘附分子来减轻C P B 时炎症反应及再灌注损伤，从而减轻心脏手术后器官功能失常，将是一个很有前景的治疗手段。氯胺酮是价格便宜的经典麻醉药物，为非巴比妥类静脉麻醉剂，主要抑制丘脑皮层系统，选择性的阻断痛觉冲动向丘脑和皮层的传导，对大脑边缘系统有兴奋作用，故静注或肌注后迅速发生特殊的全身麻醉状态。近年来的研究发现氯胺酮具有广泛的抗炎作用，它能够减轻C P B 后I L 6 的反应，离体实验亦发现其可以减少粘附分子表达和白细胞的粘附。S c h i m k i d t 等发现，氯胺酮能抑制白细胞对大鼠肠系膜血管的粘附作用，并由此减少T N F a 的生成，W e a t h e r s b y 等研究临床剂量氯胺酮下的肠系膜小静脉内皮细胞与中性粒细胞之间的相互作用，发现麻醉剂量氯胺酮可抑制外源性T N F a 引起的中性粒细胞向血管内皮细胞集聚，但该剂量还不足以抑制炎症的临床早期反应，由此推断氯胺酮也可能抑制内源性T N F 伍引起的血管内皮与中性粒细胞的相互作用。R o y t b l a t 等报道，在体外循环前单次给氯胺酮0 2 5 m g k g 可抑制冠状动脉手术中及手术后的I L 6 水平增高。L a r s e n 等研究指出，在体外培养的人全血细胞中，氯胺酮可抑制L P S 刺激的T N F a 、I L 1 1 3 释放，因此认为氯胺酮具有抗促炎因子的作用。上述实验证实了无论在体外还是在体内，氯胺酮均能从多个层面表现出对炎症反应的抑制效果。但是，对于氯胺酮在体外循环中的抗炎作用目前临床研究缺少，仍需大量的临床验证，氯胺酮抗炎中的最佳剂量、给药时机以及其作用机制更是有待进一步揭示。我们自2 0 0 0 年始尝试将氯胺酮应用于体外循环心脏手术患者的麻醉，初步发现大多数患者全身炎症反应显著减轻，术后呼吸支持时间缩短，低I I I浙江大学硕十学位论文前言心排发生率和死亡率有下降趋势。同时，由于P M N 内炎症介质c A M P 浓度的改变与其细胞功能密切相关，c A M P 是调节细胞活性和功能的重要的细胞内信号分子，其可以通过影响蛋白激酶的活性和蛋白磷酸化的途径从而影响炎症反应多个环节。因此，为进一步系统研究，拟全面观察体外循环期间不同剂量氯胺酮对P M N内炎症介质c A M P 浓度以及P M N 表面粘附分子C R 3 表达的影响，研究和论证其对心脏手术患者P M N 粘附作用的影响，从而阐明氯胺酮对体外循环患者全身炎症反应的治疗作用及其分子基础。I V浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝望盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：、 即久签字日期：胁慷r 学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝垄盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：签字日期：如明拜。矿扩式f I 胪产导师签名：签字日期：乡奴 鼬月丫日浙江大学硕十学位论文致谢致谢在不知不觉中，三年已悄然过去。我作为在职麻醉医生参与研究生学 - j ，学 - - j中我发现我的能力有非常多的不足，知识是无限的，我不断告诉自己，不断的学 - - j 才能弥补先天的缺陷。非常感谢浙江大学给我们在职人员提供的平台，特别感谢严老师在选题和研究中的悉心指导，并花费她大量的时间，她工作的热情严谨、细心、博学令人印象深刻和敬服，是她使我在研究和平时工作中开阔了视野，得到了进步。同时我要感谢省中麻醉科邹建铃主任对我在学 - j 和工作中的支持，使我顺利完成学业。也特别感谢浙二医院老师和战友陈钢、何伟、张冯江、郁丽娜等等对我学 - - j 、生活、研究上的关心和帮助。我也特别感谢我的爱人、父母对我的无限关心和支持，还有我的宝贝女儿，她是我的消疲剂。我珍惜在这三年的研究生学 - j 实践，使我终生难忘。谢谢!浙江大学硕上学位论文引言l 引言心脏手术时，体外循环( c P B ) 的许多因素可以引起机体复杂的炎性反应，如血液与心肺转流机异物表面接触，缺血再灌注损伤，内毒素的作用等。体外循环和心脏手术激活产生的全身炎症反应可导致心脏手术后并发症的产生，如呼吸功能衰竭、低心排综合征、神经系统功能紊乱等，最终可导致多脏器功能衰竭【1 ，2 1 。中性粒细胞( P M N ) 作为重要的免疫细胞，主要通过呼吸爆发和脱颗粒杀灭病原体。但激活失控的P M N 会大量释放氧自由基和多种蛋白水解酶，破坏组织细胞，是造成炎性损伤、系统性炎症反应综合征( S I R S ) 甚至多器官功能不全综合征( M O D S ) 的重要原副3 1 。氯胺酮是临床常用的麻醉药，研究发现，氯胺酮有着广泛的抗炎作用 4 - 1 5 。有关氯胺酮与c A M P 之间的关系多集中在心肌细胞，支气管平滑肌等上面1 1 6 , 1 7 】，但尚缺乏氯胺酮对炎症细胞内c A M P 的研究。本研究检测不同剂量氯胺酮下，体外循环患者P M N 内炎症介质c A M P 浓度和表面粘附分子C R 3 表达的变化，并观察其对心血管功能的影响。浙江人学硕士学位论文材料和方法2 材料和方法2 1 试验对象和分组选择拟行体外循环心脏瓣膜置换术病人6 0 例，A S AI I I V 级。随机分成四组，每组1 5 例。术前射血分数低于4 0 、血流动力学不稳定需正性肌力药物者、高血压、糖尿病、肝肾功能衰竭者、围手术期使用肾上腺激素者、感染、哮喘及免役性疾病均除外。2 2 麻醉诱导维持和取样以咪唑安定、芬太尼和维库溴铵诱导插管，术中异氟醚间断吸入和间断注射芬太尼、咪唑安定和维库溴铵维持麻醉。对照组在体外循环开始前l o 分钟经颈内静脉置管注入5 m l 生理盐水，其余三组分别在体外循环开始前l o 分钟经颈内静脉缓慢注入5 m l 氯胺酮o 1 m g k g 、o 5m g k g 和1 0m g k g 。分别于麻醉诱导前( T 0 、体外循环开始前1 0 分钟( T 2 ) 、体外循环结束后( T 3 ) 、体外循环结束后2 4 小时( T 4 )从颈内静脉采集血液标本。2 3c A M P 和e G M P 浓度的测定采用淋巴细胞分离液( 中国医学科学院天津血液研究所) 密度梯度离心法分离P M N 。冷磷酸缓冲液洗( P B S ) 2 次，细胞裂解液( 北京晶美公司) 裂解，1 5 ，0 0 0 9X5 m i n 离心收集裂解液。每个样品5 0 9 l ，采用高效液相色谱( H P L C ) 分析测定c A M P 和c G M P 的浓度，检测波长2 6 0 n m 。色谱条件为：流动相条件，N a H 2 P 0 4 ( 0 1 M ，p H 6 o ) L 腈= 9 7 3 ；流速，1 0 m l m i n ；进样量，5 0 9 l ；保留时间，7 7 m i n 。2 4C R 3 表达测定使用流式细胞仪检测P M N 表面粘附分子C R 3 的表达情况。肝素化的全血l m l用0 4 Xl m l 甲醛室温固定1 0 m i n ，红细胞裂解液裂解后重悬于l m l P B S ，并加入1 牛血白蛋白和1 y 球蛋白以阻断F c 受体。用a n t i C D l 5 P E 和a n t i C R 3 F I T C ( 加拿大B e c t o nD i c k i n s o n 公司) 荧光双标记检测P M N 及其C R 3 表达，取5 1 a l 抗体和4 5 1 a l 细胞悬液冰上避光反应3 0 m i n 后送流式细胞仪( 4 4 0 型，2浙江大学硕上学位论文材料和方法加拿大B e c t o nD i c k i n s o n 公司) 。2 5 围术期血流动力学变化和血管活性药物用量同时观察和比较患者的术中心率、血压和血管活性药物用量情况2 6 统计学处理计量资料以均数- 1 - 标准差表示，采用S S P S l 4 0 软件分析，各组间计量资料比较采用单因素方差与S N K 分析，计数资料比较采用x 2 检验。P 0 0 5 ) ，见表1 。手术种类构成比亦无显著性差异