1 维生素 C含量的定量测定2,6 二氯酚靛酚滴定法1、前言1.1 维生素 C具有的生物学意义： 对生物以及人体有意义的“维生素 C“是纯的左式右旋光（光学异构）抗坏血酸； 相对的 “ 左旋光 “ 异构物在生物体内毫无用处。 这两种是同分异构物。 但是一般广 告经常以左旋 C称呼，但事实上指的是L 型维生素 C 。 抗坏血酸是强还原剂， 当它进行作用时， 会转化为它的氧化形式为左式脱氢抗坏 血酸左式脱氢抗坏血酸经由体内的酶和谷胱甘肽可回复至活性的左式抗坏血酸 的形式。左式光抗坏血酸是一个与葡萄糖相似的弱糖酸结构，能够很自然的使氢 离子附着上去而形成抗坏血酸，或是附着金属离子，形成抗坏血酸矿物质。 1.2 维生素 C的功能作用： 在人体内，维生素 C是高效抗氧化剂， 用来减轻抗坏血酸过氧化物酶 （ascorbate peroxidase ）基底的氧化应力（ oxidative stress） 。还有许多重要的生物合成 过程中也需要维生素C参与作用。 维生素 C为 8 种不同的酵素作为电子供体： 其中 3 种参与胶原羟化。 这些反应将羟基放入氨基酸的脯氨酸或赖氨酸，再将此 氨基酸加入至胶原蛋白分子内（经由脯氨羟化酶和羟化酶），从而使胶原蛋白分 子能够承担其三重螺旋结构， 使得维生素 C必须在维护组织、 血管和软骨的时候 使用。 其中两种要参与组合肉碱。 肉碱在运输脂肪酸进入粒线体制造ATP的时候是必需 品。 剩下的三种有以下功能： 多巴胺参与肾上腺素来合成多巴胺羟化酶。 另一种酶加入胺基成为缩胺酸激素，大大增加其稳定性。 其中一种调节酪氨酸代谢。 血浆中的维生素 C的累积含量超过 100 倍的生物器官组织为肾上腺、 脑垂体、胸 腺、黄体酮及视网膜。而包括脑、脾、肺、睾丸、淋巴结、肝、甲状腺、小肠黏 膜、白血球、胰脏、肾脏、唾液腺等器官组织内的维生素C的含量也高于血浆中 的维生素 C 10 至 50 倍。1.3 维生素 C在人体中的作用维生素 C治疗坏血病是 250 年来医学证实的事实。坏血病是长期缺乏维生素C 的最终病况， 它在人体上的表现是极度疲乏，肌肉无力，皮肤肿胀疼痛， 牙龈出 血，口臭，皮下及肌肉中血管破裂出血，关节软弱，骨骼脆弱以致骨折，虚脱， 泻痢，肺脏及肾脏衰竭而导致昏迷以致死亡。由此可见维生素C对各个主要器官 都有影响。肾上腺是人体含维生素C最高的器官。 人体在紧张的时候， 肾上腺分泌大量的肾 上腺素到全身的肌肉中，准备好随时动作，应付危机。肾上腺素是从酪氨酸 （Tyrosine ）制成多巴（ Dopa ） ，转化成多巴胺（ Dopamine ） ，再转化为降肾上腺 素（Noradrenaline ） ，最后制成肾上腺素（ Adrenaline ） 。其中每一步骤都要消2 耗维生素 C进行羟基化反应 （Hydroxylation） 。这是为什么人和动物的肾上腺必 须储备大量维生素C的原因。胶原（Collagen ）是一种蛋白质， 它存在人体的结缔组织、 血管和骨骼的组织及 牙本质细胞之间。它的机械强度超过同重量的钢铁， 是动物体型的基本支撑物质。 所以它可以使细胞排列紧密，皮肤紧致， 骨骼牙齿坚固。 当受到外伤时或是手术 后它可以帮助细胞修复、促进伤口的愈合。维生素 C促进胶原质的形成。 胶原质是由两种氨基酸， 赖氨酸（ Lysine ）和脯氨 酸（Proline ） ，组合成的聚合巨分子。 胶原质的强度是因为消耗维生素C方才使 吡咯氨酸醇化而加强了巨分子间的吸引力。缺乏维生素C时胶原质的强度不足， 则所有的器官组织都减弱而产生各种疾病，最严重的时候就成为坏血病。 正常人 的血管壁细胞， 由于有胶原质填塞所以能排列整齐，并确保其严密性。 当缺乏维 生素 C时，血管组织的严密性受到损害，只要外界稍加压力，血液即自行渗出， 这就是所谓的坏血病最表面的现象。合成胶原质时必定消耗维生素C ，所以要维 持身体各个器和组织器官的健康，必须经常摄取足够的维生素C。坏血病是维生素 C枯竭的终结症状， 它最明显的特征就是血管系统的崩溃。在长 期缺乏维生素 C的情况下，血管的组织减弱因此导致各种心脏和血管的疾病。血 管之中冠状动脉是受压力最高的部分，为了防止冠状动脉渗血及破裂，血管自行 修补的方法一是加厚血管而使血管硬化，二是沈积胆固醇堵塞渗血的漏洞而使血 管阻塞。赖斯医师 Rath 和鲍林 Pauling 发现大量的维生素C加上离氨基酸（ Lysine ）和 吡咯氨基酸（ Proline ）可以清除冠状动脉现有沈积的粥样硬化块（Plaques） 。癌细胞其实普遍存在人体的许多组织中，但是它们不能无限制地增长和扩散，只 形成良性肿瘤。 只有在胶原质减弱时， 癌细胞才能溶化胶原质的屏障，从原始病 灶扩展到其它的组织和器官，对人体造成危害。平时维持足够的维生素C，可以 降低癌症发生率。癌症病人服用大量维生素C，可以延缓癌细胞的扩展，甚至压 制癌细胞的生长。眼睛中的晶状体和视网膜都含有高浓度的维生素C。缺乏维生素 C时，晶状体中 的胶原质就失去它的透明性而产生白内障。维生素 C也可以降低眼球内液体的压 力，避免青光眼的病症。卡尼汀（ Carnitine ）是一种氨基化合物，它在肌肉组织中帮助肌肉获得收缩需 要的能量。卡尼汀也是由离氨酸（Lysine ）经过醇化而制成的。这个醇化反应， 也要消耗维生素 C 。卡尼汀是脂肪酸氧化产生能量之重要运送者，因此当维生素 C缺乏时，就会使人感到精神不济，同时血液中亦会积存多量的中性脂肪。维生素 C可以增强血管的组织和减少血液中胆固醇的含量，对于动脉硬化性心脏 血管的疾病与高血压、 中风等的成人病都有很好的预防和治疗效果。缺乏维生素 C时，胆固醇不易分解成胆酸，而使血清胆固量提高，容易导致血管粥状硬化及 血栓症。3 人类和动物的免疫系统的主要工作是由白血球和淋巴球来完成的。白血球和淋巴 球中维生素 C的含量是血液中维生素C含量的 30 倍。白血球和淋巴球必须有足 够维生素 C才能吞噬滤过性病毒与细菌， 所以人体的免疫力， 是和维生素 C的存 量是切切相关的。 维生素 C有很强的还原的能力。 体内许多生化反应都需要维生 素 C的帮助才得以完成。 维生素 C可避免白血球受自体氧化的伤害，因此可强化 免疫系统。服用大量维生素 C会增加血液中 IgA，IgG 及 IgM 等抗体的浓度。这些抗体附着 在外来的病毒和细菌上，指引白血球和淋巴球来将它们消灭。维生素 C可以帮助钙、 磷、铁这类的矿物质在小肠的吸收，所以对于贫血或是骨 质疏松症者很有帮助。大多数钙、磷、铁的化合物，都不溶于水，所以不容易被 人体吸收。 维生素 C的钙、磷、铁盐则有很高的水溶解性，所以能够帮助这类的 矿物质在小肠的吸收。维生素 C是一种抗氧化极强的物质， 对于人体长期暴露在不良的环境中（过氧化 脂质、抽烟、喝酒、虫蛇咬伤及许多化学毒素）所产生的自由基物质，都可以有 效的清除。医学界认为自由基与癌症或老化的发生有关。亚硝酸胺是一种致癌物 质，体内若有足量维生素C存在时，就可以防止腌肉用的亚硝酸转化产生亚硝酸 胺。维生素 C参与人体内许多的生化反应， 缺乏维生素 C时这些反应都不能顺利进行， 在许多相关的器官中产生病变。大多数动物都能在肝脏中自行生产维生素C ，所 以很少会染上伤风，感冒，冠状动脉阻塞和癌症这些人类特有的病症。2. 实验目的学习并掌握测定维生素C的原理和方法 了解蔬菜水果中维生素C的含量情况3. 实验原理维生素 C (又称抗坏血酸 ) 属水溶性维生素，是人类营养中最重要的维生素之一， 缺乏时得坏血病。它广泛存在于植物中，尤以蔬菜和水果含量丰富。 维生素 C有强的还原性，在中性和微酸性环境中它能将蓝色的染料2，6-二 氯酚靛酚还原成无色的还原型2,6- 二氯酚靛酚，同时自身被氧化成脱氢抗坏血 酸。 氧化型的2,6- 二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝 色。所以，当用2,6- 二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸 全部被氧化后，再滴下的2,6- 二氯酚靛酚将立即使溶液呈淡红色，从而显示到 达滴定终点。 如无其他杂质干扰， 样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含 的还原型抗环血酸量成正比。 此法操作简便， 但存在下列缺点： 生物组织中的脱氢抗环血酸及结合抗环 血酸同样具有维生素C的生理作用， 不能用此法测出。 生物材料提取液中含有 的其他还原性物质，也可使2,6- 二氯酚靛酚还原脱色而引起误差。提取液中 常存在的色素类物质干扰滴定终点的观察。4 由于提取液中其他还原性物质还原2,6- 二氯酚靛酚的速度较慢， 故可将滴定 过程控制在 2min 之内，并判断终点以淡红色1530s内不消失为准。 当提取液绿 色素太多， 严重干扰终点判断时， 可先用白陶土或氢氧化铝乳液脱色。这些措施 可以在一定程度上减少测量误差。4. 实验设备50ml 三角瓶 4个；50ml 容量瓶 1 个； 大离心管 2 支；20ml量筒 1 个； 移液管 10ml 2 支；离心机； 研钵；碱式滴定管1 支5. 实验材料及试剂实验材料：猕猴桃 试剂： （1）1% 草酸溶液 （2）2% 草酸溶液 （3）0.005mg/ml 标准维生素 C溶液：准确称取维生素C20mg ，用 1% 草酸 溶液定容至 200ml。吸取此液 10ml，以 1% 的草酸溶液稀释定容至200ml。临用时 配，冰箱中贮存。 （4）0.005mg/ml2,6- 二氯酚靛酚溶液： 称取干燥的 2,6- 二氯酚靛酚 60mg ， 放入 200ml 的容量瓶中，加热蒸馏水100150ml，滴加 0.01mg/ml NaOH 溶液 45 滴，强烈摇动 10min，冷却后加水至刻度，摇匀后用滤纸过滤，放入棕色瓶中。 贮存在冰箱中备用，有效期一周，使用前标定。6. 实验操作步骤6.1 样品提取 ：取 1g猕猴桃，加 5ml2% 草酸溶液， 于研钵中研磨成浆状， 将提取 液及渣子一起转移到离心管中，用20ml2% 草酸溶液分 23 次冲洗研钵，洗液一 并转入离心管中。在其中加入6ml 氢氧化铝乳液（也可用适量白陶土代替），摇 匀并静置约5min，然后 3000r/min的转速离心1520min，上清液转移到50ml 容量瓶中，用 2% 草酸溶液定容至刻度，摇匀备用。 6.2 标准液的滴定 ：准确吸取 0.005mg/ml 标准为标准维生素C溶液 10ml，放入 50ml，同时吸取 10ml1% 草酸溶液于另一个50ml 三角瓶中作空白对照。用已标定 的 2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色出现，且 15s 内不消失，记录所用毫升数。 计算每毫升 2，6-二氯酚靛酚溶液所能氧化的毫克数。 6.3 样液的滴定 ：准确吸取样液两份，每份10.0ml ，分别放入两个50ml 锥形瓶 中用标定过的 2，6- 二氯酚靛酚溶液滴定，空白样滴定方法如前。7. 结果及计算每 100g 样品中抗坏血酸的量（ mg ）=100)(321WVVKVV5 式中：1V为滴定样液所用染料体积（ml）; 2V为滴定空白样所用染料体积（ml） ；3V为样品测定时所用的滤液体积（ml）V为样品提取液稀释的总体积（ml）K为 1ml2，6-二氯酚靛酚溶液所能氧化的抗坏血酸的量（mg/ml）, 可由 标定计算；W为 10ml 样液相当于含样品的量（g）8. 注意事项（1） 滴定过程宜迅速进行，一般不应超过2min。滴定所用染料应在14ml 之 间，若滴定结果超出此范围，则必须增、减样品量或将提取液适当稀释。 （2） 2%草酸溶液可抑制抗坏血酸氧化酶，1% 草酸溶液则不能， 偏磷酸也有同样 功效。若样品中含有大量亚铁离子，可用8% 醋酸溶液提取。亚铁离子能 还原 2，6-二氯酚靛酚。 （3） 如浆状物泡沫很多，可加数滴辛醇或丁醇。 （4） 样品提取液应避免日光9. 费用预算猕猴桃 5 元