1菊花叶中总黄酮提取及对自由基清除作用的研究作者：林砚淋 王志良，陈婷，王彧，胡志军，陈建秋【摘要 】 目的优化菊花叶中总黄酮的提取工艺，考察菊花叶总黄酮抗氧化活性。方法采用 L9 (34 ) 正交实验, 考察浸提剂浓度、料液比、浸提时间和温度等影响因素;研究 D-101 大孔吸附树脂分离富集菊花叶提取液中总黄酮;参照 Fenton 反应原理研究菊花叶总黄酮的清除OH 中作用。结果菊花叶总黄酮的最佳提取工艺为：40 %乙醇溶液为提取溶剂，采用料液比 120 ( mV) ，在 60 下浸提 2.5 h;D-101 大孔吸附树脂能较好分离富集菊花叶黄酮类物质;菊花叶中总黄酮对 Fenton 体系产生的OH 有较好的清除作用。结论该研究为菊花叶中有效成分的综合利用提供了实验基础。 【关键词】 菊花叶; 总黄酮; 提取; 正交实验 ; 清除自由基菊花叶，是菊科(Compsitae) 植物菊花脑 Dendranthema nankingense 的干燥嫩茎叶。菊花叶为江苏地产药材，味苦、辛，性凉，具有清热解毒，疏风平肝之功能，主治风火赤眼、鼻炎、咽喉肿痛、支气管炎、疮疖肿痛等。菊花叶含有丰富的蛋白质、脂肪、纤维素、矿物质、盐等，其中维生素 A 和矿物质含量最为突出，另含有具防癌作用的黄酮类和具特殊香味的挥发油芳香物质。由于其2含有特殊的营养成分，食用可清热解毒、开胃健脾，对防治流感、流脑、肝炎、痢疾有非常好的作用1。现代研究表明，黄酮类化合物是菊花叶乙醇提取液中含量较多的有效成分，因其具有显著的清除人体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂、降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂2。目前主要运用乙醇-水溶剂提取、碱性稀醇提取、超声波和超临界流体萃取等方法对药用植物中黄酮类化合物进行提取3，然后采用大孔吸附树脂对黄酮类化合物进行分离富集4，最后利用 Fenton 反应等多种自由基产生体系研究其抗氧化能力5。近年来有关菊花叶中活性成分黄酮类物质的研究报道较少，为此本实验以菊花叶为研究对象，考察了溶剂浓度、料液比、浸提时间和温度等因素对菊花叶中黄酮类物质提取的影响，并采用正交实验进行工艺条件优化，用 D101 大孔吸附树脂对菊花叶黄酮提取液进行富集，最后还研究了菊花叶黄酮对 Fenton 体系产生的OH 的清除作用，为证明其药用价值提供科学依据。1 材料1.1 仪器 BS124 型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);HD 型恒温水浴锅 (上海分析仪器厂);SHB-循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);UV-9100 紫外/可见分光光度计 (北京瑞利分析仪器有限公司);高速 FW80 型万能粉碎机(天津华鑫仪器厂) 。31.2 试剂 95%乙醇、三氯甲烷、盐酸、水杨酸、氢氧化钠、硝酸铝、过氧化氢(南京化学试剂有限公司);石油醚( 无锡市亚盛化工有限公司);醋酸乙酯(上海凌峰化学试剂有限公司); 丙酮(上海实验试剂有限公司);七水合硫酸亚铁 (广东汕头市西陇化工厂 )。以上试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。分别将试剂配成如下使用液：氢氧化钠溶液(质量分数 4%);硝酸铝溶液(质量分数 10%);亚硝酸钠溶液(质量分数 5%);乙醇(体积分数 95%、70%、40% );硫酸亚铁溶液(3.0 mmol/L);过氧化氢溶液(2.5 mmol/L);水杨酸-乙醇溶液(3.0 mmol/L)。1.3 材料将市售菊花叶置于 65 的恒温干燥箱中干燥 48 h后粉碎，过 80 目筛，储存备用;芦丁( 生化试剂，纯度为 95% 国药集团化学试剂有限公司);D101 大孔吸附树脂(天津市南开大学化工厂)。2 方法2.1 芦丁标准曲线的绘制精密称取芦丁标准品 23.20 mg，置于 100 ml 容量瓶中，加入适量 70%乙醇溶液，置于温水中加热使溶解，再用 70%乙醇溶液定容，摇匀，即得 220.4 g/ml 的芦丁标准品溶液。精密移取标准品溶液40.05，0.10，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00 ml 于25 ml 容量瓶中，分别加入 5%亚硝酸钠溶液 1.00 ml，摇匀放置 6 min，加入 10%硝酸铝溶液 1.00 ml，摇匀放置 6 min，加入 4%氢氧化钠溶液 10.00 ml，加去离子水定容至刻度，摇匀放置 15 min，在 500 nm 处测吸光度，以溶剂作空白，去离子水作参比，重复测量 3 次，取其平均值，绘制曲线可得吸光度 A 与芦丁浓度 C (g/ml)的线性回归方程6(如下图 1 所示)：A = 0.011 6C + 0.004 9，r= 0.999 6，说明芦丁浓度 C 在 0.4461.71 g/ml 浓度范围内与吸光度 A 之间有较好的线性关系。图 1 线性关系2.2 菊花叶总黄酮提取及测定影响菊花叶中总黄酮提取的因素主要有提取剂乙醇浓度、样品质量与乙醇体积比(料液比)、浸提时间和温度等3,7。选择 L9(34)正交表研究浸渍法提取菊花叶总黄酮的最佳工艺条件。实验时准确称取 1.50 g 菊花叶粉末和规定量的乙醇溶液置于装有回流装置的圆底烧瓶中，按照 L9(34)正交表进行提取实验。实验结束后，过滤得总黄酮滤液，取其滤液在 500 nm处测定吸光度，然后根据标准曲线方程即可计算出样品中总黄酮的浸出量(mg/g)。2.3 菊花叶总黄酮的提纯研究黄酮类化合物结构中常常连接有酚羟基、甲氧基、甲基和黄酮苷元等官能团，大多数黄酮苷元宜用极性较小的溶剂，如用氯仿、乙醚、丙酮、醋酸乙酯等萃取，而5对多甲基黄酮的游离苷元甚至可用苯进行萃取8。利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取可达到精制富集的目的。实验中先回收菊花叶总黄酮提取液的乙醇得到总黄酮的水溶液，再用 3 BV 石油醚处理直到石油醚萃取液显无色为止，以便除去脂肪酸等脂溶性成分，然后选用多个溶剂系统分别对上述提取液进行多次处理，以萃取率(计算公式如下)为指标，考察不同萃取溶剂系统对总黄酮萃取效果的影响，从而选择出最佳的萃取溶剂系统。萃取率(*)=m 样品-m 对照 m0100%式中：m 样品(g)为经折算后的萃取液中的总黄酮质量;m 对照(g)为萃取液中的非黄酮经折算成总黄酮的质量; m0(g)为加入菊花叶处理液中总黄酮的质量。大孔树脂吸附分离技术是 20 世纪 60 年代发展起来的一种固液柱层析分离技术，具有价廉、吸附容量大、可反复使用等优点，因此在天然产物有效成分特别是黄酮类化合物的精制纯化中已被广泛应用，而且呈良好的发展趋势9。本实验利用 D-101 大孔吸附树脂对菊花叶总黄酮进行精制纯化10，洗脱剂乙醇浓度为 70%，吸附速度为 2 ml/min，乙醇用量为 4 倍柱体积，分步收集洗脱液(0.5倍柱体积/管) ，测出各管洗脱液中总黄酮的含量，绘制总黄酮的洗脱曲线。2.4 清除羟自由基研究参照 Fenton 反应原理及李贵荣11的方法改进后进行测定。利用 H2O2 与 Fe2+混合产出OH ，但由于OH 具有很高的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水6杨酸，就能有效地捕捉OH，并产生有色物质。反应如下：H2O2+ Fe2+Fe3+OH+OH-OH 此产物在 508 nm 处有强吸收，若在此反应体系中加入具有清除OH 功能的被测物，便会与水杨酸竞争OH ，从而使有色物质生产量减少。将配制好 3.0 mmol/L 硫酸亚铁溶液、2.5 mmol/L 过氧化氢溶液、3.0 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液、一定浓度的样品提取液，按下表 1 的顺序依次加入到 25 ml的比色管中，加去离子水至刻度，振荡静置 10 min 后，以去离子水为参比，于 508 nm 处测吸光度值，代入公式计算清除率。见表1。其计算公式如下：清除率(%)=A 对照-(A 样品-A0)/A 对照100%式中：A 对照为没有加样品的吸光值;A 样品为加样品的吸光值;A0 为没有加显色剂的吸光值。3 结果与讨论3.1 菊花叶总黄酮提取工艺的优化影响菊花叶总黄酮提取的主要因素有提取剂乙醇浓度、样品质量与乙醇体积比(料液比)、浸提温度和反应时间等，本实验采用表 2 所示的正交实验因素水平表，通过正交筛选法选出最佳的实验条件，实验结果如表 3 所示。上述实验所用正交表除各因子外，由于无空白列做对照，所以采用常规方法，由正交表中极差项可知因素 B 和因素 D 的 R 值非常接近，因此将均方中 B 和 D 项均近似作为误差项，但在实际中以B 项来计算各因素的 F 值和 P 值进行显著性判断。从表 4 方差分析7结果表明，在 95%置信水平下，从菊花叶提取总黄酮的工艺参数中，A 因素和 C 因素影响高度显著，B 和 D 因素影响可忽略。综合极差分析和方差分析可知上述 4 种影响因素的主次顺序为：ACBD。菊花叶总黄酮提取的最佳浸提条件是A3B2C1D2，即以 40%乙醇为提取溶剂，采用料液比 120(mV)，在 60 下提取 2.5 h，测定吸光度，得到菊花叶总黄酮单位浸出量为 72.485 4 mg/g。表 1 OH 实验加样表表 2 正交因素水平表表 3 L9(34)正交实验与结果表 4 方差分析表3.2 菊花叶总黄酮的提纯3.2.1 菊花叶总黄酮的萃取提纯分别使用醋酸乙酯、氯仿和氯仿-醋酸乙酯(11)3 种溶剂系统对菊花叶总黄酮水溶液进行连续萃取，以 3 次累积萃取率为指标确定最佳萃取溶剂系统。实验结果如表 5 所示，从表中可以看出 3 种溶剂系统的菊花叶总黄酮的累积萃取率都不高，可能的原因是菊花叶中黄酮类物质的极性比较大，而实验所用的 3 种溶剂系统中只有醋酸乙酯极性中等，其他溶剂系统极性比较小，由相似相溶原理可知菊花叶总黄酮在这些溶剂系统中的溶解性较差。由实验结果可知，采用醋酸乙酯作为萃取溶剂时，菊花叶总黄酮的累积萃取率最高可达 17.26%。3.2.2 菊花叶总黄酮的柱色谱提纯大孔吸附树脂预处理：取8适量 D-101 大孔吸附树脂用 3 BV 无水乙醇浸泡 24 h，倾倒上层乙醇，然后装入玻璃层析柱，用无水乙醇以 2B V/h 的流速通过树脂层，至流出液加去离子水不呈浑浊为止，并用去离子水以相同的流速冲洗树脂层至流出液没有醇味为止;然后用 2 BV 5%稀盐酸溶液以2 ml/ min 流速通过树脂层，并浸泡 1 h 后用去离子水以相同的流速冲洗树脂层至流出液 pH 值为中性;最后用 2 BV 4%氢氧化钠溶液以 2 ml/min 流速通过树脂层，并浸泡 1 h 后用去离子水以相同的流速冲洗树脂层至流出液 pH 值为中性。表 5 不同萃取系统对菊花叶黄酮水溶液的累积萃取效果将“3.2.1”节中醋酸乙酯总黄酮萃取液 4.00 ml(经测定，总黄酮浓度为 202.8 g/ml)拌适量预处理过的大孔吸附树脂，挥干再采用湿法装柱干法上样。以洗脱液体积(BV)为横坐标，单位洗脱量(g/BV)和累积洗脱量(g)，做室温下70%乙醇分离提纯总黄酮的洗脱曲线如图 2 所示。图 2 菊花叶总黄酮的洗脱曲线由单位洗脱量曲线可以看出，当洗脱液体积1 BV 时，单位洗脱量随着洗脱液的增加而递减;而当洗脱体积为 3.5 BV 时总黄酮基本被洗脱下来。由累积洗脱量曲线可以看出，当洗脱液体积1.5 BV时，随着洗脱液增加，累积洗脱量增加缓慢;当洗脱液体积为 3.5 BV时几乎达到洗脱极限，此时总黄酮的累积洗脱率为 102.2%。93.3 清除羟自由基研究结果将 “3.2.2”节中经 D-101 大孔吸附树脂分离富集的菊花叶总黄酮提取液进行清除羟自由基研究