药品的卫生学检查方法介绍（北京市药品检验所 戴红）1l无菌室的质量管理l药品的微生物限度检查l药品的无菌检查2无菌室的要求l位置选择l面积大小l洁净度l采光l紫外杀菌l门l人流物流l地面墙面3无菌室的管理l陈设尽量简单，仅放置必需用的仪器设备l无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭擦拭操作台及可能污 染的死角，室内无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。l人员：肥皂洗手， 0.1%新洁尔灭洗手，换无菌服、鞋，进入。l操作必须符合无菌要求，穿好无菌服后，不能反复出入无菌间， 手不能来回出入操作台。l在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去空气 湿气，用紫外灯杀菌半小时。 l非无菌室工作人员不得进入，对外来维修人员要进行监督。l缓冲间不得放杂物、培养箱等。l定期对门、窗、墙面等消毒。l定期检查洁净度情况。4洁净度的要求应在环境洁净度10000级局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须无菌。工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游 菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。5l尘埃粒子l洁净级别 尘粒数/m3 活微生数（个）/m3l 0.5um 5uml100级 3,500 0 5l1000级 350,000 20,00 100l100000级 3,500,000 20,000 500lGB/T16294-1996l沉降菌l洁净级别 个/（90mm.0.5h）l100级 1 l10000级 3l100000级 106菌种保存、复壮及管理l保存原则 l保存方法l复壮l管理7菌种的保存原则l挑选特征典型的纯菌菌落l确定保存的合适菌体形态，凡能产生孢子或芽孢的微 生物都用孢子或芽孢保存l选择最适宜的保存方法进行保存l定期对保存的菌种进行检查8菌种保存的常用方法l琼脂斜面低温保存法l甘油冷冻管保藏法l半固体琼脂斜面低温保存法l液体石蜡保存法l超低温保存法（菌种）l砂土 9菌种的复壮l分离纯化：琼脂平板分离、单细胞（菌体或孢子）的 分离l通过宿主复壮l淘汰退化l理化因素诱变10菌种的管理l专人管理，加锁保存在冰箱内，保存菌种的冰箱不得 放置食品及易挥发性试剂及有机溶媒等l定期有专人按操作规程进行传代接种l菌种定期检查，发现染菌及变异现象应及时报告，研 究处理。l实验菌种不得任意带出l使用致病菌时应及时通知保管人员，用后必须及时处 理11菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26003 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10104 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64941 白色念珠菌(Candida albicans) CMCC(F) 98001 黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F) 98003 大肠埃希菌(Escherichia coli) CMCC(B) 44102 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CMCC(B) 6350112菌液的制备（1）l接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜 绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤中 ， 3035培养1824小时，取此培养 液1ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml，采用 10倍递增稀释法，稀释至10-5 10-7，使 细菌数约为10100cfu/ml。13菌液的制备（2）l接种白色念珠菌的新鲜培养物至改 良马丁培养基中， 2328 培养 1824小时，取此培养物1ml加0.9 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增 稀释法，稀释至10-5 10-7，使细菌 数约为50100cfu/ml。14菌液的制备（3）l 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马 丁琼脂斜面培养基上， 2328 培 养57天，加35ml0.9无菌氯化 钠溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液 ，取1 ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml ，采用10倍递增稀释法，稀释至10- 410-6，使细菌数约为50100cfu/ml。 15药品微生物限度检查方法介绍162005年版微生物限度标准的应用 微生物限度检查法：检查非规定灭菌制剂及其原料、 辅料受微生物污染程度的方法。是判定药品受到微生 物污染程度的重要指标，也是对生产企业的设备器具 、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生 学评价的综合依据之一。 药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料 的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药 品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度检查 均以本标准为依据。 检查项目：细菌数、霉菌数、酵母菌数及 控制菌的检 查。172005年版微生物限度标准的分类l1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的 制剂 应符合无菌检查法的规定。l2、口服给药制剂l3、局部给药制剂3.1. 用于手术、烧伤及严重损伤的局部给药制剂无菌3.2. 眼部给药制剂：3.3、耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂 3.4、阴道、尿道给药制剂3.5、直肠给药制剂3.6、其它局部给药18l4、含动物组织（包括提取物）的口服给药制 剂l5、有兼用途径的制剂应符合各给药途径的标准l6、霉变、长螨者 以不合格论l7、原料及辅料参照相应制剂的微生物限度标准执行19供试品的抽样及检验取量l一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量的3倍量 （以备复试）。贵重药品检验量可以酌减（至少要够 各种菌检查用的溶液）。l所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位（中药密丸 、膜剂，需取自4丸、4片以上）。l固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10g。l液体制剂检验量为10ml。l膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为50m2,化学药及 生化药膜剂检查量为10cm2。l抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问 的样品，但明显破裂的包装不得作为样品。l凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出 长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格 品，无需再抽样检验。20供试品的保存l供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿 冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件 不妥引起致死或繁殖。l供试品在检验之前，应保持原包装状态，严 禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品 。21细菌、霉菌、酵母菌计数22实验前的准备工作l将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试 管、吸管（1ml、10ml）量筒等移到无菌室内，每次试 验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作 中出入，操作编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。l开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作 不低于30min。l操作人员用肥皂洗手，关闭紫外灯，进入缓冲间，换 工作鞋。再用0.1%新洁尔灭或其他消毒液洗手或用乙 醇棉球擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。l操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙 醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋的开口处周围，待干 后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。23平板菌落计数法l供试液制备 （10倍递增稀释）l注平皿l倒培养基摇合 （45营养琼脂 玫瑰红钠琼脂 YPD琼脂培养基）l倒置培养 （ 3035 48小时；252872小时）l菌落点数 （30300个 30100个）l菌数报告 （10条原则）24供试液的制备（1）l乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应证明是有效的， 并对微生物无毒性。l水浴加温时，温度不超过45，时间不超过30分钟。l供试液从制备到加入培养基，不超过1小时。l供试液的体积：最终体积为100ml。25供试液的制备（2）l稀释剂：pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液l肠溶制剂pH7.6磷酸盐缓冲液、 pH6.8磷酸盐缓冲液l非水溶性供试品乳化剂：5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚 山梨酯80的无菌混合物（事先配制好、灭菌消 毒）。十四烷酸异丙酯萃取或过滤26供试液的制备（3）液体供试品 取供试品10ml，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂至 100ml ，摇匀，作为1:10供试液。含王浆或蜂蜜的液体制剂和滴眼剂直接用供试品作为供试液。l固体、半固体或粘稠供试品，称取供试品10g，置于匀浆杯或适 当灭菌容器中，加入稀释剂至100ml ，用匀浆仪（3000-5000r/ ，24min）、振荡器或乳钵研磨等方法混匀。胃溶胶囊加稀释 剂后置451水浴振摇，肠溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后 451水浴振摇。27供试液的制备（4）l非水溶液性供试品 软膏剂、乳膏剂、称供试品5g（5ml），加 到含已灭菌溶化并45保温的乳化剂的烧杯中，用无菌玻棒搅拌 混匀后，慢慢加入45左右的稀释剂85ml，边加边搅拌，使供试 品充分乳化，作供试液（1:20）。l油剂取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯80 5 8ml，摇匀，再 加入稀释剂至100ml。l栓剂，称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45水浴保 温10min，使溶，加入灭菌聚山梨酯80 58ml，振摇使之乳化，再加稀 释剂（稀释剂和聚山梨酯80总量为100ml），摇匀。28供试液的制备l气雾剂 ，将供试品置冰箱（4-8）1h，取出，用碘伏棉球（也 可用乙醇棉球）擦拭试品开启部位周围，然后以无菌钢锥钻 孔 并插入容器中，勿移出钢锥 ，以转动 方式使容器抛射剂全部抛 出。以无菌注射器吸出全部溶液，按标示量补加稀释剂 至足量 （若含非水溶性成分，加适量无菌聚山梨酯80液）此液即为供 试品原液。l膜剂 将药膜剪成碎片，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂 至100ml ，于451水浴中保温，振摇使溶。l茶剂，取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂 至100ml， 振摇30s,以灭菌纱布过滤 ，（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称 样结 果按1：10加稀释剂 ，浸泡30min）。l以上供试品如吸水膨胀，或粘度过高，可增加稀释剂 ，制成 1:201:100供试液。 29供试品溶液的制备（5）（含抑菌成分的供 试品）稀释法：10ml供试液种入较大体积的培养基中，一般不超过1000ml离心沉淀法：3000rpm，30min，底部2ml稀释至10ml。500rpm,5min，上清 液再离心集菌薄膜过滤法：0.45um的滤膜，冲洗3次，每次至少100ml中和法：磺胺类 100ml增菌液中含1%的对氨基苯甲酸1ml砷、汞类 100ml硫乙醇酸盐培养基洗必泰类 100ml增菌液中加适量的聚山梨酸80等表面活性剂沉降法：自然沉降5min，取上层液置100ml增菌液中30供试液的稀释（10倍递增稀释法）l10g 100ml 1:101ml 10ml 1:1001ml 10ml 1:1000l至少3个稀释级，每递增1个稀释级，必须更换吸管。l管内混合吹打不少于10次，吸液在液面下2.5cm处，放 液在液面上1cm处，延内壁缓缓吹出全部溶液，然后 将吸管放入消毒液缸内。31注平皿l在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取 各种稀释液各1ml至每个灭菌平皿中（从高稀释级至低